Metabolit imunomodulator nyan keuh fitur utama dari lingkungan mikro tumor (TME), tapi ngen padum-padum boh pengecualian, identitas jih sebagian rayeuk teutap hana diketahui. Di sinoe, kamoe meuanalisis tumor ngon sel T dari tumor ngon ascites pasien karsinoma serous bertingkat tinggi (HGSC) untuk mengungkapkan metabolom kompartemen TME nyang berbeda nyoe. Ascites ngon sel tumor na perbedaan metabolit nyang luah. Dibandingkan ngon ascites, sel T nyang meuinfiltrasi tumor nyan signifikan geupeukaya ngon 1-metilnikotinamida (MNA). Meskipun tingkat MNA lam sel T meningkat, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim nyang mengkatalisis transfer kelompok metil dari S-adenosilmetionin keu nikotinamida) teubatas bak fibroblas ngon sel tumor. Secara fungsional, MNA geu induksi sel T keu geu peu ek sitokin faktor nekrosis tumor alfa nyang mempromosikan tumor. Oleh kareuna nyan, MNA nyang berasal dari TME berkontribusi bak regulasi imun sel T ngon mewakili target imunoterapi potensial keu pengobatan kanker manusia.
Metabolit nyang berasal dari tumor jeut na efek penghambat nyang mendalam bak imunitas anti-tumor, dan seumaken le bukti nyang menunjukkan bahwa metabolit nyan jeut cit berfungsi seubagoe pendorong kunci keu perkembangan peunyaket (1). Seulaen efek Warburg, karya baroe-baroe nyoe ka mulai geucirikan keadaan metabolisme sel tumor ngon hubungan jih ngon keadaan imun lingkungan mikro tumor (TME). Penelitian bak model tikoh ngon sel T manusia kaleuh menunjukkan bahwa metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) ngon metabolisme glukosa (4) jeut bertindak secara mandiri bak berbagai subkelompok sel imun. Na padum-padum boh metabolit bak jalur nyoe geuhambat fungsi anti-tumor sel T. Kaleuh terbukti bahwa blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) jeut keu peureuloh proliferasi sel T, ngon peningkatan BH4 lam tuboh jeut keu peningkatan respon imun anti-tumor nyang dimediasi le CD4 ngon CD8. Seulaen nyan, efek imunosupresif kynurenin jeut diselamatkan ngon pemberian BH4 (5). Bak glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), sekresi enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) geuhambat aktivasi sel T, proliferasi ngon Aktivitas sitolisis (6). Baroe-baroe nyoe, kaleuh dipeudeuh bahwa metilglioksal, produk sampingan dari glikolisis, diproduksi uleh sel supresor nyang berasal dari myeloid, ngon transfer sel T metilglioksal jeuet menghambat fungsi sel T efektor. Lam pengobatan, netralisasi metilglioksal jeut geuatasi aktivitas sel supresor nyang berasal dari myeloid (MDSC) ngon secara sinergis meningkatkan terapi blokade pos pemeriksaan bak model tikoh (7). Studi nyoe secara kolektif menekankan peran kunci metabolit nyang berasal dari TME lam mengatue fungsi ngon aktivitas sel T.
Disfungsi sel T ka le that dilaporkan bak kanker ovarium (8). Hal nyoe sebagian disebabkan oleh karakteristik metabolisme nyang meulekat bak hipoksia ngon vaskular tumor abnormal (9), nyang menghasilkan konversi glukosa ngon triptofan jeut keu produk sampingan lagee asam laktat ngon kynurenin. Laktat ekstraseluler nyang berlebihan nyan mengurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) ngon mendorong diferensiasi subkelompok mielosupresif. Konsumsi triptofan secara langsong menghambat proliferasi sel T dan menghambat pensinyalan reseptor sel T (12-14). Terlepas dari pengamatan nyoe, le that pekerjaan seputar metabolisme imun nyang ji lakukan lam kultur sel T in vitro ji pakek media nyang ji optimalkan, atawa ji teubatas bak model tikoh homolog lam vivo, hana nyang sepenuh jih ji cerminkan heterogenitas kanker manusia ngon lingkungan makro ngon mikro fisiologis.
Saboh ciri umum kanker ovarium nakeuh penyebaran peritoneum ngon munculnya asma. Akumulasi cairan sel lam ascites na hubungan ngon peunyaket nyang ka lanjut dan prognosis nyang hana get (15). Meunurot laporan, kompartemen nyang unik nyoe hipoksik, na tingkat faktor pertumbuhan endotel pembuluh darah (VEGF) ngon indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO) nyang tinggi, ngon ji infiltrasi le sel pengatur T ngon sel penghambat myeloid (15-18). Lingkungan metabolisme ascites mungken berbeda ngon tumor nyan keudroe, sehingga pemrograman ulang sel T lam ruang peritoneum hana jeulah. Seulaen nyan, perbedaan kunci ngon heterogenitas antara ascites ngon metabolit nyang na lam lingkungan tumor jeut menghambat infiltrasi sel imun ngon fungsi jih bak tumor, ngon perle penelitian leubeh lanjot.
Untuk tapeuseuleusoe masalah-masalah nyoe, kamoe meurancang saboh metode pemisahan sel sensitif ngon kromatografi cair tandem spektrometri massa (LC-MS/MS) untuk meurunoe jenis sel nyang berbeda (termasuk sel CD4 + dan CD8 + T) serta lam dan antara tumor Metabolit jih membentang sel-sel lam lingkungan pasien asma dan tumor nyang sama. Kamoe meupake metode nyoe lam hubungan jih ngon sitometri aliran dimensi tinggi ngon urutan RNA sel tunggal (scRNA-seq) keu geubri potret nyang that terselesaikan dari status metabolisme populasi kunci nyoe. Metode nyoe ji peugah na peningkatan signifikan lam kadar 1-metilnikotinamida (MNA) lam sel T tumor, dan percobaan in vitro ji peugah bahwa efek imunomodulator MNA bak fungsi sel T seugolom jih hana ji teupeu. Secara umum, metode nyoe geu peugah interaksi metabolisme nyang saleng antara tumor ngon sel imun, ngon geubri wawasan nyang unik keu metabolit regulasi imun, nyang mungken berguna keu pengobatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T Peluang pengobatan.
Kamoe meungui sitometri aliran dimensi tinggi keu meu-uko secara bersamaan pengambilan glukosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukosa (2-NBDG) dan aktivitas mitokondria tanda khas nyang meubedakan sel imun ngon populasi sel tumor (Tabel S2 ngon Gambar S1A). Analisis nyoe menunjukkan bahwa dibandingkan ngon sel T, ascites ngon sel tumor na tingkat pengambilan glukosa nyang leubeh tinggi, tapi na perbedaan nyang leubeh ubeut lam aktivitas mitokondria. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] nakeuh lhee sampoe peut kali lipat dari sel T, dan rata-rata pengambilan glukosa sel CD4 + T nakeuh 1,2 kali lipat dari sel CD8 + T, nyang menunjukkan Tumor infiltrasi limfosit lam TME memerlukan metabolisme nyang berbeda (TIL). Sebalik jih, aktivitas mitokondria lam sel tumor saban ngon sel CD4 + T, ngon aktivitas mitokondria bak kedua jenis sel nyan leubeh tinggi nibak sel CD8 + T (Gambar 1B). Seucara umum, hasee nyoe meungkap tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor leubeh manyang nibak sel CD4 + T, dan aktivitas metabolisme sel CD4 + T leubeh manyang nibak sel CD8 + T. Meskipun efek nyoe bak mandum jenis sel, hana perbedaan nyang konsisten lam status metabolisme sel CD4 + ngon CD8 + T atawa proporsi relatif jih lam ascites dibandengkan ngon tumor (Gambar 1C). Sebalik jih, bak fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ lam tumor meningkat dibandengkan ngon ascites (Gambar 1D). Kamoe pih meu-amati perbedaan metabolisme nyang jeulaih antara komponen sel EpCAM+ ngon EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) na pengambilan glukosa ngon aktivitas mitokondria nyang leubeh tinggi nibak sel EpCAM-, nyang jioh leubeh tinggi nibak aktivitas metabolisme fibroblas lam sel tumor lam TME (Gambar 1, E ngon F).
(A dan B) Intensitas fluoresensi median (LKM) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) dan aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker mirah gelap) (B) Grafik perwakilan (wi) dan data tabulasi (Uneun), sel CD8 + T dan sel tumor EpCAM + CD45-. (C) Rasio sel CD4 + ngon CD8 + (dari sel CD3 + T) lam asma ngon tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM + lam asma ngon tumor (CD45-). (E dan F) EpCAM + CD45-tumor dan EpCAM-CD45-matriks pengambilan glukosa (2-NBDG) (E) dan aktivitas mitokondria (MitoTracker mirah gelap) (F) grafik perwakilan (wi) dan data tabulasi ( Uneun) Asma dan sel tumor. (G) Grafik perwakilan ekspresi CD25, CD137 dan PD1 deungon sitometri aliran. (H ngon I) Ekspresi CD25, CD137 ngon PD1 bak sel CD4 + T (H) ngon sel CD8 + T (I). (J dan K) Fenotip naif, memori pusat (Tcm), efektor (Teff) dan memori efektor (Tem) berdasarkan ekspresi CCR7 dan CD45RO. Gambar perwakilan (wi) ngon data tabular (uneun) sel CD4 + T (J) ngon sel CD8 + T (K) lam asma ngon tumor. Nilai P ditentukan deungon uji t berpasangan (*P<0,05, **P<0,01 dan ***P<0,001). Gareh nyan mewakili pasien nyang cocok (n = 6). FMO, pendar minus saboh; LKM, intensitas pendar median.
Analisis leubeh lanjot geu peugah perbedaan signifikan laen antara status fenotipik sel T nyang that terselesaikan. Memori nyang ka diaktifkan (Gambar 1, G sampoe I) ngon efektor (Gambar 1, J ngon K) lam tumor jioh leubeh seureng nibak ascites (proporsi sel CD3 + T). Meunan cit, menganalisis fenotipe ngon ekspresi penanda aktivasi (CD25 ngon CD137) ngon penanda depletion [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] menunjukkan bahwa meskipun karakteristik metabolisme populasi nyoe berbeda (Gambar S1, B sampoe E) , Tapi hana perbedaan metabolisme signifikan nyang diamati secara konsisten (Gambar S1). F keu I). Hase nyoe geukonfirmasi ngon geupake metode pembelajaran meusen untuk geubri fenotipe sel secara otomatis (21), nyang leubeh lanjot geupeuleumah na sejumlah rayeuk sel sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) lam ascites pasien (Gambar S2A ). Di antara mandum jenis sel nyang ka geuidentifikasi, populasi sel myeloid nyoe geutunyok pengambilan glukosa ngon aktivitas mitokondria nyang paleng manyang (Gambar S2, B sampoe G). Hase nyoe menunjukkan perbedaan metabolisme nyang teuga antara padum-padum boh jenis sel nyang diteumee bak ascites ngon tumor bak pasien HGSC.
Tantangan utama lam meuphom karakteristik metabonomi TIL nakeuh keubutuhan untuk geuisolasi sampel sel T nyang murni, kualitas ngon kuantitas nyang cukop dari tumor. Studi baroe-baroe nyoe ka geutunyok bahwa cara penyortiran ngon pengayaan manik-manik berdasarkan sitometri aliran jeut menyebabkan perubahan profil metabolit seluler (22-24). Untuk geuatasi masalah nyoe, kamoe geuoptimalkan metode pengayaan manik-manik untuk geuisolasi dan geuisolasi TIL dari kanker ovarium manusia nyang direseksi secara bedah sigohlom geuanalisis le LC-MS/MS (kalon Bahan dan Metode; Gambar 2A). Untuk menilai dampak keseluruhan protokol nyoe ateuh perubahan metabolit, kamoe meubandeng profil metabolit sel T nyang diaktifkan le donor nyang sehat lheuh langkah pemisahan manik-manik di ateuh ngon sel-sel nyang hana dipisahkan manik-manik tapi teutap di ateuh es. Analisis kontrol mutu nyoe meuteumee bahwa na korelasi nyang tinggi antara dua kondisi nyoe (r = 0,77), ngon keu ulang teknis dari kelompok 86 metabolit na keu ulang nyang tinggi (Gambar 2B). Oleh kareuna nyan, metode nyoe jeut geupeuget analisis metabolit nyang akurat lam sel nyang mengalami pengayaan tipe sel, sehingga menyediakan platform resolusi tinggi phon untuk mengidentifikasi metabolit spesifik lam HGSC, sehingga memungkenkan ureung untuk meurumpok pemahaman nyang leubeh dalam teuntang spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Diagram skematik pengayaan manik magnet. Sigohlom geuanalisis ngon LC-MS/MS, sel-sel nyan akan geualami lhee boh putaran pengayaan manik magnetik meuturot-turot atawa teutap ateuh es. (B) Peungaroh jeuneh pengayaan ateuh kelimpahan metabolit. Rata-rata lhee boh pengukuran keu tiep-tiep jeuneh pengayaan ± SE. Gareh abu-abu nyan mewakili hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) dari pengukuran nyang meu ulang-ulang nyang dipeudeuh lam label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematik alur kerja analisis metabolit pasien. Ascites atawa tumor nyan geukumpoi bak pasien dan geukeubah lam krio. Seubagian ubeut dari tiep-tiep sampel dianalisis ngen sitometri aliran, sedangkan sampel yang teusisa dijalani lhee putaran pengayaan untuk sel CD4+, CD8+ dan CD45-. Fraksi sel-sel nyoe geuanalisis ngon LC-MS/MS. (D) Peta suum keulimpahan metabolit nyang ka standar. Dendrogram mewakili pengelompokan Ward dari jarak Euclidean antar sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) dari peta metabolit sampel, geupeuleumah lhee replika dari tiep sampel, sampel dari pasien nyang sama geuhubongkan le saboh gareh. (F) PCA profil metabolit sampel nyang dikondisikan bak pasien (yaitu, menggunakan redundansi parsial); jeunèh sampel nyan geubatasi lé lambung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Seulaen nyan, kamoe meuterapkan metode pengayaan nyoe untuk menganalisis 99 metabolit lam fraksi sel CD4 +, CD8 + dan CD45 lam asma dan tumor primer nam droe pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A dan Tabel S3 dan S4). Populasi nyang dipeureulee mencapai 2% sampoe 70% dari sampel rayeuk asli sel udep, ngon proporsi sel that bervariasi antar pasien. Lheuh geupisah manik-manik, fraksi nyang dipeukaya nyang dipeureulee (CD4+, CD8+ atawa CD45-) meujumlah leubeh dari 85% dari mandum sel udep lam sampel rata-rata. Metode pengayaan nyoe memungkenkan geutanyoe untuk ta analisa populasi sel dari metabolisme jaringan tumor manusia, nyang hana mungken tapeuget dari sampel nyang rayeuk. Deungon protokol nyoe, kamoe meuteunte bahwa l-kynurenin ngon adenosin, dua metabolit imunosupresif nyang bercirikan get nyoe meuningkat lam sel T tumor atawa sel tumor (Gambar S3, B ngon C). Kareuna nyan, hasee nyoe menunjukkan kesetiaan ngon kemampuan pemisahan sel ngon teknologi spektrometri massa geutanyoe untuk meurumpok metabolit nyang peunteng secara biologis lam jaringan pasien.
Analisis kamoe pih meungkap pemisahan metabolisme nyang teuga dari jenis sel lam dan antara pasien (Gambar 2D dan Gambar S4A). Secara khusus, dibandengkan ngon pasien laen, pasien 70 geupeuleumah karakteristik metabolisme nyang beda (Gambar 2E ngon Gambar S4B), nyan menunjukkan bahwa mungken na heterogenitas metabolisme nyang substansial antara pasien. Peureulèë tapeu ingat bahwa meunyoë tabandéng ngon pasien laén (1,2 sampoë 2 liter; Tabel S1), jumlah total ascites nyang geukumpôi bak pasien 70 (80 ml) leubeh ubit. Kontrol heterogenitas antar pasien watee analisis komponen utama (misal jih, geupake analisis redundansi parsial) geupeuleumah perubahan nyang konsisten antara jenis sel, ngon jenis sel ngon/atau lingkungan mikro jeulaih geuagregasi meunurot profil metabolit (Gambar 2F ). Analisis metabolit tunggal menekankan efek nyoe ngon mengungkapkan perbedaan nyang signifikan antara jenis sel ngon lingkungan mikro. Perlu diperhatikan bahwa perbedaan nyang paleng ekstrim nyang diamati nakeuh MNA, nyang biasa jih dipeukaya lam sel CD45- dan lam sel CD4+ ngon CD8+ nyang menyusup lam tumor (Gambar 3A). Keu sel CD4 +, efek nyoe paleng jeulaih, dan MNA lam sel CD8 + pih deuh that dipeungaroh le lingkungan. Teuman nyoe hana peunteng, sabab dari nam droe pasien nyan cuma lhee droe nyang jeut dievaluasi untuk skor CD8+ tumor. Seulaen MNA, lam berbagai jenis sel lam ascites ngon tumor, metabolit laen nyang hana get ciri khas lam TIL pih kaya secara berbeda (Gambar S3 ngon S4). Oleh kareuna nyan, data nyoe ji peugah saboh rangkaian metabolit imunomodulator nyang menjanjikan keu penelitian leubeh lanjot.
(A) Kandungan MNA nyang ka normal lam sel CD4+, CD8+ ngon CD45- dari asma ngon tumor. Plot kotak nyan geupeuleumah median (gareh), rentang antarkuartil (engsel bingkai) ngon rentang data, sampoe 1,5 kali rentang antarkuartil (kumih bingkai). Lagee nyang dipeugah lam Bahan dan Metode Pasien, pakek nilai limma pasien untuk neuteupeu nilai P (*P<0,05 dan **P<0,01). (B) Gambar skema metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, ribosa nikotinamida; NMN, mononukleotida nikotinamida. Enzim (hijo): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, boh keunong; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferase; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE dari scRNA-seq dari asma (abu-abu) dan tumor (mirah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT lam populasi sel nyang berbeda nyang diidentifikasi deungon menggunakan scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT ngon AOX1 lam SK-OV-3, ginjal embrio manusia (HEK) 293T, sel T ngon sel T nyang dirawat ngon MNA. Ekspresi nyang meulipet nyan geupeuleumah relatif ngon SK-OV-3. Pola ekspresi ngon SEM geupeuleumah (n = 6 donatur nyang sehat). Nilai Ct nyang leubeh nibak 35 geuanggap hana jeuet jiteumee (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 ngon SLC22A2 bak SK-OV-3, HEK293T, sel T ngon sel T nyang geurawat ngon MNA 8mM. Ekspresi nyang meulipet nyan geupeuleumah relatif ngon SK-OV-3. Pola ekspresi ngon SEM geupeuleumah (n = 6 donatur nyang sehat). Nilai Ct nyang leubeh nibak 35 geuanggap hana jeuet jiteumee (UD). (G) Kandungan MNA sel lam sel T donor nyang sehat nyang ka diaktifkan lheuh 72 jeum inkubasi ngon MNA. Pola ekspresi ngon SEM geupeuleumah (n = 4 donatur nyang sehat).
MNA dipeuget deungon cara dipinah kelompok metil dari S-adenosil-1-metionin (SAM) keu nikotinamida (NA) deungon nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT nyan ji ekpresikan le that bak macam-macam kanker manusia dan na hubungan ngon proliferasi, invasi dan metastasis (25-27). Untuk leubeh meuphom sumber MNA lam sel T lam TME, kamoe pakek scRNA-seq untuk meukarakterisasi ekspresi NNMT lintas jenis sel lam ascites dan tumor lhee droe pasien HGSC (Tabel S5). Analisis kira-kira 6.500 sel geupeuleumah bahwa lam lingkungan ascites ngon tumor, ekspresi NNMT teubatah bak populasi fibroblas ngon sel tumor nyang geuduga (Gambar 3, C ngon D). Perlu diperhatikan bahwa hana ekspresi NNMT nyang jeulaih bak populasi peu mantong nyang mengekspresikan PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D dan Gambar S5A), nyang menunjukkan bahwa MNA nyang dideteksi lam spektrum metabolit ka dipeutamong lam sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) geuubah MNA jeuet keu 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atawa 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4- PYR); Gambar 3B) cit geubatasi bak populasi fibroblas nyang mengekspresikan COL1A1 (Gambar S5A), nyang bersama-sama menunjukkan bahwa sel T hana kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen nyang berhubungan ngon MNA nyoe geuverifikasi ngon geupake set data sel independen keudua dari ascites dari pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Seulaen nyan, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor nyang sehat nyang dirawat ngon MNA geupeuleumah bahwa meunyo tabandeng ngon sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT atawa AOX1 karap hana diekspresikan (Gambar 3E). Hase nyang hana terduga nyoe menunjukkan bahwa MNA jeut disekresikan dari fibroblas atawa tumor keu sel T nyang toe lam TME.
Meskipun calon mencakup keluarga pengangkut kation organik 1 sampoe 3 (OCT1, OCT2 dan OCT3) yang dikodekan oleh keluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 dan SLC22A3), pengangkut potensial MNA mantong hana didefinisikan (28). QPCR mRNA dari sel T donor nyang sehat geupeuleumah tingkat ekspresi SLC22A1 nyang rendah tapi tingkat SLC22A2 nyang hana jeuet dideteksi, nyang geukonfirmasi bahwa nyan ka geulaporkan seugolom jih lam literatur (Gambar 3F) (29). Sebalik jih, gareh sel tumor ovarium SK-OV-3 menunjukkan tingkat tinggi dari kedua transporter (Gambar 3F).
Untuk geu uji kemungkenan sel T na kemampuan untuk geu serap MNA aseng, sel T donor nyang sehat geu budidayakan seulama 72 jeum deungon na konsentrasi MNA nyang beda. Meunyo hana MNA eksogen, kandungan seluler MNA hana jeuet ta deteksi (Gambar 3G). Namun, sel T nyang ka diaktifkan nyang dirawat ngon MNA eksogen menunjukkan peningkatan kandungan MNA nyang bergantung bak dosis lam sel, sampoe 6 mM MNA (Gambar 3G). Hase nyoe menunjukkan bahwa meskipun tingkat ekspresi transporter nyang rendah ngon kureung jih enzim utama nyang bertanggung jawab ateuh metabolisme MNA intraseluler, TIL mantong jeut mengambil MNA.
Spektrum metabolit lam sel T pasien ngon eksperimen absorpsi MNA in vitro meningkatkan kemungkenan fibroblas nyang terkait kanker (CAF) mengeluarkan MNA ngon sel tumor jeut mengatur fenotipe ngon fungsi TIL. Untuk geu peutente efek MNA bak sel T, sel T donor nyang sehat geu aktifkan secara vitro ngen na atawa hana MNA, ngon proliferasi ngon produksi sitokin jih geu evaluasi. Lheueh 7 uroe geutamah MNA bak dosis nyang paleng manyang, jumlah penggandaan populasi moderat meukureng, seudangkan kekuatan teutap bak mandum dosis (Gambar 4A). Seulaen nyan, pengobatan MNA eksogen meuhasekan peningkatan proporsi sel T CD4 + ngon CD8 + nyang mengekspresikan faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sebalik jih, produksi intraseluler IFN-γ secara signifikan menurun bak sel CD4 + T, tapi hana bak sel CD8 + T, dan hana perubahan signifikan bak interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C dan D). Kareuna nyan, assay imunosorben nyang meuhubong ngon enzim (ELISA) dari supernatan dari kultur sel T nyang geurawat ngon MNA nyoe geupeuleumah peningkatan TNFα nyang signifikan, penurunan IFN-γ, ngon hana perubahan IL-2 (Gambar 4, E sampoe G). . Penurunan IFN-γ nyan menunjukkan bahwa MNA mungken berperan lam menghambat aktivitas anti-tumor sel T. Untuk geu simulasikan efek MNA bak sitotoksisitas nyang dimediasi le sel T, sel reseptor antigen kimerik T (FRα-CAR-T) nyang geutargetkan reseptor folat α ngon CAR-T (GFP) nyang geu atoe le sel protein fluoresen ijo (GFP) -CAR-T) geu produksi le sel donor nyang sehat mononuar darah tepi PBMC. Sel CAR-T ji peu udep seulama 24 jeum ngen na MNA, dan leuh nyan ji peu udep bersama ngen sel tumor ovarium SK-OV-3 manusia nyang ji ekspresikan reseptor folat α bak rasio efektor keu target 10:1. Peulakuan MNA meuhase keu penurunan aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T nyang signifikan, nyang saban ngon sel FRα-CAR-T nyang dirawat ngon adenosin (Gambar 4H).
(A) Total jumlah sel layak dan penggandaan populasi (PD) langsong dari kultur bak uroe 7. Grafik batang mewakili rata-rata + SEM dari nam droe donor nyang sehat. Meuwakili data dari setidak jih n = 3 eksperimen independen. (B sampoe D) CD3/CD28 ngon IL-2 geungui keu geuaktivasi sel T bak konsentrasi MNA maseng-maseng seulama 7 uroe. Sigohlom geu analisa, sel-sel geu rangsang ngon PMA/ionomisin ngon GolgiStop seulama 4 jeum. Ekspresi TNFα (B) lam sel T. Contoh gamba (wi) ngon data tabular (uneun) ekspresi TNFα lam sel-sel udep. Ekspresi IFN-γ (C) ngon IL-2 (D) lam sel T. Ekspresi sitokin geu uko ngen sitometri aliran. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 6 donatur nyang sehat) + SEM. Gunakan analisis varians saboh arah dan ukuran ulang (*P<0,05 dan **P<0,01) untuk neuteupeu nilai P. Meuwakili data dari setidak jih n = 3 eksperimen independen. (E sampoe G) CD3/CD28 ngon IL-2 geungui keu geuaktivasi sel T bak konsentrasi MNA maseng-maseng seulama 7 uroe. Media nyan geukumpoi seugohlom ngon lheuh 4 jeum stimulasi PMA/ionomisin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) ngon IL-2 (G) geu uko ngon cara ELISA. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 5 donatur nyang sehat) + SEM. Nilai P ditentukan deungon menggunakan analisis varians saboh arah dan pengukuran berulang (*P<0,05). Gareh puteh-puteh nyan nakeuh tanda bataih deteksi deteksi. (H) Assay lisis sel. Sel FRα-CAR-T atawa GFP-CAR-T geu-adjust ngon adenosin (250μM) atawa MNA (10 mM) seulama 24 jeum, atawa geubi hana geurawat (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 geu uko. Nilai P nyang ditentukan ngon uji t Welch (*P<0,5 dan **P<0,01).
Untuk meurumpok pemahaman mekanistik teuntang regulasi ekspresi TNFα nyang bergantung bak MNA, perubahan mRNA TNFα sel T nyang dirawat MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sel T donor nyang sehat nyang geurawat ngen MNA geu peutunyok peningkatan dua ge tingkat transkripsi TNFα, nyan geu tunjukkan bahwa MNA nyan bergantung bak regulasi transkripsi TNFα. Untuk menyelidiki kemungkenan mekanisme pengaturan nyoe, dua faktor transkripsi nyang dituri nyang mengatur TNFα, yaitu faktor nuklir sel T nyang diaktifkan (NFAT) ngon protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi sebagai respon terhadap ikatan MNA keu promotor TNFα proksimal ( 30 ). Promotor TNFα na 6 teumpat meuikat NFAT nyang ka jiidentifikasi ngon 2 teumpat meuikat Sp1, nyang tumpang tindeh bak saboh teumpat [-55 pasangan basa (bp) dari 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) geu peutunyok bahwa watee geu peulaku ngen MNA, ikatan Sp1 keu promotor TNFα meningkat lhee goe. Peugabong NFAT pih meutamah dan meutamah peunteng (Gambar 5B). Data nyoe menunjukkan bahwa MNA mengatur ekspresi TNFα melalui transkripsi Sp1, dan sebatas yang leubeh ubeut ekspresi NFAT.
(A) Dibandingkan ngon sel T nyang dibudidayakan hana MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα lam sel T nyang dirawat ngon MNA. Pola ekspresi ngon SEM geupeuleumah (n = 5 donatur nyang sehat). Meuwakili data dari setidak jih n = 3 eksperimen independen. (B) Promotor TNFα sel T nyang dirawat ngon atawa hana MNA 8 mM lheuh NFAT ngon Sp1 digabongkan ngon stimulasi (Ctrl) ngon PMA/ionomisin seulama 4 jeum. Imunoglobulin G (IgG) ngon H3 maseng-maseng geu pakek seubagoe kontrol negatif ngon positif keu imunopresipitasi. Kuantifikasi ChIP geupeuleumah bahwa ikatan Sp1 ngon NFAT keu promotor TNFα lam sel nyang geurawat ngon MNA meutamah padum-padum go dibandengkan ngon kontrol. Meuwakili data dari setidak jih n = 3 eksperimen independen. Nilai P ditentukan deungon padum-padum boh uji t (*** P <0,01). (C) Dibandingkan ngon ascites HGSC, sel T (non-sitotoksik) menunjukkan peningkatan ekspresi TNF lam tumor. Warna-warna nyan mewakili pasien nyang beda-beda. Sel-sel nyang geupeuleumah ka geucok sampel seucara acak sampoe 300 dan geujitter untuk geubatasi gamba nyang leubèh (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA nyang geuusulkan keu kanker ovarium. MNA dipeuget lam sel tumor ngon fibroblas lam TME ngon dicok le sel T. MNA nyan meningkatkan ikatan Sp1 bak promotor TNFα, nyang menyebabkan meningkatkan transkripsi TNFα ngon produksi sitokin TNFα. MNA pih jeut keu seubab IFN-γ meunuron. Inhibisi fungsi sel T nyan menyebabkan kemampuan pembunuhan berkurang dan pertumbuhan tumor dipercepat.
Meunurot laporan, TNFα na efek anti-tumor ngon anti-tumor nyang meugantung bak ukeu ngon likot, tapi na peran nyang ka jituri lam promosi pertumbuhan ngon metastasis kanker ovarium (31-33). Meunurot laporan, konsentrasi TNFα lam jaringan ascites ngon tumor bak pasien kanker ovarium leubeh tinggi nibak jaringan jinak (34-36). Lam hai mekanisme, TNFα jeut geu atoe aktivasi, fungsi ngon proliferasi sel darah puteh, ngon geu ubah fenotipe sel kanker (37, 38). Konsisten ngon temuan nyoe, analisis ekspresi gen diferensial menunjukkan bahwa TNF secara signifikan terregulasi lam sel T lam jaringan tumor dibandengkan ngon ascites (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF hanya terbukti bak populasi sel T ngon fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkat jih, data nyoe mendukung pandangan bahwa MNA na efek imunosupresif ganda ngon promosi tumor bak HGSC.
Pelabelan fluoresen berdasarkan sitometri aliran kaleuh jeut keu metode utama keu meurunoe metabolisme TIL. Studi nyoe ka geutunyok bahwa meunyo tabandeng ngon limfosit darah tepi atawa sel T dari organ limfoid sekunder, TIL murine ngon manusia na kecenderungan nyang leubeh tinggi keu geucok glukosa (4, 39) ngon gadoh fungsi mitokondria secara bertahap (19, 40). Meskipun kamoe ka meuamati hasee nyang saban lam penelitian nyoe, perkembangan kunci nakeuh untuk meubandengkan metabolisme sel tumor ngon TIL dari jaringan tumor nyang ka direseksi nyang sama. Konsisten ngon padum-padum boh laporan seugolom jih nyoe, sel tumor (CD45-EpCAM +) dari ascites ngon tumor na pengambilan glukosa nyang leubeh tinggi daripada sel CD8 + ngon CD4 + T, mendukung bahwa pengambilan glukosa nyang tinggi dari sel tumor jeut dibandengkan ngon sel T. Konsep persaingan sel T nyan. TME. Namun, aktivitas mitokondria sel tumor leubeh tinggi dari sel CD8 + T, tapi aktivitas mitokondria saban ngon sel CD4 + T. Hase nyoe geupeukong tema nyang teuka bahwa metabolisme oksidatif nyan peunteng keu sel tumor (41, 42). Awak nyan cit geusarankan bahwa sel CD8+T mungken leubeh rentan terhadap disfungsi oksidatif daripada sel CD4+T, atawa sel CD4+T mungken menggunakan sumber karbon selaen glukosa untuk mempertahankan aktivitas mitokondria (43, 44). Perlu diperhatikan bahwa kamoe hana mengamati perbedaan dalam pengambilan glukosa atau aktivitas mitokondria antara efektor CD4 + T, memori efektor T dan sel memori pusat T lam ascites. Meunan cit, keadaan diferensiasi sel CD8 + T lam tumor hana hubungan ngon perubahan pengambilan glukosa, menyorotkan perbedaan signifikan antara sel T nyang dibudidayakan in vitro ngon TIL manusia in vivo (22). Pengamatan nyoe cit dikonfirmasi ngon penggunaan alokasi populasi sel otomatis nyang hana bias, nyang leubeh lanjot geupeugah bahwa sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ngon pengambilan glukosa ngon aktivitas mitokondria nyang leubeh tinggi nibak sel tumor nyang prevalen tapi na populasi sel aktif Metabolik. Populasi nyoe jeut mewakili subpopulasi nyang diduga sel supresor mieloid atawa sel dendritik plasmasitoid nyang diidentifikasi lam analisis scRNA-seq. Meskipun kedua jih ka geulaporkan bak tumor ovarium manusia [45], awak nyan mantong peurlee Pekerjaan leubeh lanjot nakeuh untuk geugamba subpopulasi myeloid nyoe.
Meskipun metode berbasis sitometri aliran jeuet mengklarifikasi perbedaan umum lam glukosa ngon metabolisme oksidatif antara jeuneh sel, metabolit nyang teupat nyang dihasekan uleh glukosa atawa sumber karbon laen jih keu metabolisme mitokondria lam TME golom ditentukan. Menetapkan na atawa hana metabolit keu subset TIL terteunte perle pemurnian populasi sel dari jaringan nyang dipotong. Oleh kareuna nyan, metode pengayaan sel tanyo nyang digabongkan ngen spektrometri massa jeut geubri wawasan teuntang metabolit nyang dipeukaya secara berbeda lam sel T ngon populasi sel tumor lam sampel pasien nyang cocok. Meskipun metode nyoe na keuntungan ateuh penyortiran sel nyang diaktifkan fluoresensi, perpustakaan metabolit terteunte jeut terpengaroh kareuna stabilitas nyang melekat ngon/atau tingkat perputaran nyang bagah (22). Namun lagee nyan, metode kamoe jeut geuidentifikasi dua boh metabolit imunosupresif nyang diakui, adenosin ngon kynurenin, kareuna awak nyan that bervariasi antara jenis sampel.
Analisis metabonomi kamoe keu tumor ngon subtipe TIL geubri leubeh le wawasan keu peran metabolit lam TME ovarium. Phon, ngon tangui flow cytometry, kamoe meuteunte bahwa hana perbedaan aktivitas mitokondria antara tumor ngon sel CD4 + T. Namun, analisis LC-MS/MS geupeuleumah perubahan nyang signifikan lam kelimpahan metabolit di antara populasi nyoe, geutunyok bahwa kesimpulan teuntang metabolisme TIL ngon aktivitas metabolisme jih secara keseluruhan peureulee interpretasi nyang hati-hati. Keudua, MNA nakeuh metabolit nyang paleng rayeuk perbedaan antara sel CD45 ngon sel T lam ascites, kon tumor. Oleh karena nyan, kompartementalisasi ngon lokasi tumor mungken na efek nyang berbeda bak metabolisme TIL, nyang menyorot kemungkenan heterogenitas lam lingkungan mikro terteunte. Keulhee, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT terutama terbatas bak CAF, nyang merupakan sel tumor lam batas nyang leubeh ubeut, tapi kadar MNA nyang jeut dideteksi diamati bak sel T nyang berasal dari tumor. Ekspresi berlebihan NNMT bak CAF ovarium na efek promosi kanker nyang ka jiteupeu, sebagian kareuna promosi metabolisme CAF, invasi tumor ngon metastasis (27). Meskipun tingkat TIL secara keseluruhan moderat, ekspresi NNMT lam CAF na hubungan erat ngon subtipe mesenkim Atlas Genom Kanker (TCGA), nyang na hubungan ngon prognosis nyang hana get (27, 46, 47). Akhe jih, ekspresi enzim AOX1 nyang bertanggung jawab ateuh degradasi MNA pih terbatas bak populasi CAF, nyang menunjukkan bahwa sel T hana kemampuan untuk metabolism MNA. Hase nyoe mendukong gagasan bahwa meskipun perle pekerjaan leubeh lanjot keu verifikasi temuan nyoe, tingkat MNA nyang tinggi lam sel T mungken menunjukkan na jih lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Meuingat tingkat ekspresi transporter MNA nyang miyub ngon tingkat protein kunci nyang hana terdeteksi nyang terlibat lam metabolisme MNA, kehadiran MNA lam sel T hana terduga. Get NNMT atawa AOX1 hana jeut dideteksi ngen analisis scRNA-seq ngon qPCR nyang ditargetkan dari dua kohort independen. Hase nyoe menunjukkan bahwa MNA hana disintesis le sel T, tapi diserap dari TME di sekitar jih. Eksperimen in vitro geu peutunyok bahwa sel T cenderung mengumpulkan MNA eksogen.
Studi in vitro kamoe ka geu peutunyok bahwa MNA eksogen geu induksi ekspresi TNFα lam sel T ngon geu peu ek ikatan Sp1 keu promotor TNFα. Meskipun TNFα na fungsi anti tumor ngon anti tumor, bak kanker ovarium, TNFα jeut mempromosikan pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα lam kultur sel tumor ovarium atawa penghapusan sinyal TNFα lam model tikoh jeut keu peningkatan produksi sitokin inflamasi nyang dimediasi TNFα ngon menghambat pertumbuhan tumor (32, 35). Kareuna nyan, lam hai nyoe, MNA nyang berasal dari TME jeut bertindak seubagoe metabolit pro-inflamasi melalui mekanisme nyang bergantung bak TNFα melalui loop autokrin, sehingga mempromosikan terjadinya dan penyebaran kanker ovarium (31). Berdasarkan kemungkenan nyoe, blokade TNFα teungoh dipeulajari seubagoe agen terapeutik potensial keu kanker ovarium (37, 48, 49). Seulaen nyan, MNA mengganggu sitotoksisitas sel CAR-T keu sel tumor ovarium, geubri bukti leubeh lanjot keu supresi imun nyang dimediasi MNA. Secara kolektif, hasee nyoe menunjukkan model dipat tumor ngon sel CAF mengeluarkan MNA keu TME ekstraseluler. Meulalui (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium nyang geu induksi le TNF ngon (ii) inhibisi aktivitas sitotoksik sel T nyang geu induksi le MNA, nyoe mungken na efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulan jih, deungon geuterapkan kombinasi pengayaan sel nyang bagah, urutan sel tunggal ngon profil metabolisme, penelitian nyoe geupeuleumah perbedaan imunometabolomik nyang rayeuk that antara tumor ngon sel ascites bak pasien HGSC. Analisis komprehensif nyoe menunjukkan bahwa na perbedaan lam pengambilan glukosa ngon aktivitas mitokondria antara sel T, ngon mengidentifikasi MNA sebagai metabolit pengatur imun otonom non-sel. Data nyoe na dampak bak kiban TME mempengaruhi metabolisme sel T lam kanker manusia. Meskipun persaingan langsong keu nutrisi antara sel T ngon sel kanker kaleuh geu laporkan, metabolit pih jeut bertindak sebagei regulator hana langsong keu mempromosikan perkembangan tumor ngon mungken menekan respon imun endogen. Deskripsi leubeh lanjot tentang peran fungsional metabolit pengatur nyoe jeut geu buka strategi alternatif keu geu tingkatkan respon imun anti-tumor.
Spesimen pasien ngon data klinis jiteumee lewat repositori jaringan tumor kanker BC nyang jisertifikasi le Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Meunurot protokol nyang ka jisetujui le Komite Etika Penelitian Kanker BC ngon Universitas British Columbia (H07-00463), mandum spesimen pasien ngon data klinis jiteumee persetujuan tertulis nyang ka jiinfomasikan atawa secara resmi ji peulheuh persetujuan awak nyan. Sampel nyan geukeubah lam BioBank nyang ka geusertifikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien nyang rinci geupeuleumah lam Tabel S1 ngon S5. Keu kriopreservasi, pisau bedah geupake keu geuuraikan sampel tumor pasien seucara mekanis lheuh nyan geudorong lewat filter 100 mikron keu geucok suspensi sel tunggal. Ascites pasien geu sentrifugasi bak 1500 rpm seulama 10 minet bak suhu 4°C untuk geu pelet sel-sel dan geu peugadeh supernatan. Sel nyang jiteumee dari tumor ngon asma ji peutheun lam 50% serum AB manusia nyang hana ji aktifkan le suum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Ilmiah) ngon 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal nyang geupeutheun nyoe geucairkan ngon geupake keu metabolomik ngon penentuan metabolit nyang geujelaskan di yup.
Media nyang leungkap nyan terdiri dari 0,22 μm nyang disaring 50:50 ditambah RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Ilmiah Termo Fisher) ditambah ngon 10% serum AB manusia nyang hana diaktifkan le suum (Sigma-Aldrich), Hepes 12,5 mM (Ilmiah Fisher Termo), 2 mM l-glutamin (Ilmiah Fisher Termo) Larutan streptomisin (PenStrep) ngon 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) geutamah ngon Hepes 20 mM (Termo Nelayan Ilmiah) ngon 2 mM l-glutamin (Termo Nelayan Ilmiah). Penyangga pewarnaan sitometer aliran terdiri dari 0,22μm salin penyangga fosfat nyang disaring (PBS; Invitrogen) nyang ditambah ngon 3% serum manusia AB nyang hana diaktifkan le suum (Sigma). Penyangga pengayaan sel nyan terdiri dari PBS nyang ka disaring 0,22μm dan ditambah ngon serum AB manusia nyang hana diaktifkan le suum 0,5% (Sigma-Aldrich).
Lam media lengkap 37°C, sel-sel diwarnai ngon 10 nM MT DR ngon 100 μM 2-NBDG seulama 30 minet. Seulanjot jih, sel-sel nyan diwarnai ngen pewarna viabilitas eF506 bak suhu 4°C seulama 15 minet. Suspend lom sel-sel lam Blok FC (eBioscience) ngon Penyangga Noda Brilian (BD Biosciences), encerkan lam penyangga pewarnaan sitometer aliran (meunurot petunjuk pabrikan), ngon inkubasi seulama 10 minet bak suhu ruangan. Pewarnaan sel-sel ngon saboh set antibodi (Tabel S2) lam penyangga pewarnaan sitometri aliran bak suhu 4°C seulama 20 minet. Disuspensi lom sel-sel lam penyangga pewarnaan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sigohlom dianalisis. Pakèk SpectroFlo ngon FlowJo V10 keu ta analisa data hitongan sel, ngon tapeuguna GraphPad Prism 8 keu tapeugot data nyan. Intensitas fluoresensi median (MFI) 2-NBDG ngon MT DR dinormalisasi log, lheuh nyan tes t nyang meupasang dipakek keu analisis statistik keu menjelaskan pasien nyang cocok. Peuhah mandum populasi nyang kureung dari 40 kejadian dari analisis; tapeutamong nilai LKM 1 keu nilai negatif peu mantong sigohlom tapeulaku analisis statistik ngon visualisasi data.
Untuk meuleungkap strategi gating manual dari panel proses di ateuh, kamoe meupakek anotasi lengkap le bak pembatasan bentuk (FAUST) (21) untuk secara otomatis menetapkan sel keu populasi lheuh menghilangkan sel mate lam FlowJo. Kamoe secara manual mengelola output keu meugabongkan populasi nyang deuh jih salah alokasi (meugabongkan PD1+ ngon sel tumor PD1) ngon populasi nyang dipeutheun. Tiëp-tiëp sampel na rata-rata leubèh nibak 2% sel, keu total 11 populasi.
Sentrifugasi kepadatan gradien ficoll dipakek untuk meupisah PBMC dari produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL). Sel CD8 + T geuisolasi dari PBMC ngon geupake CD8 MicroBeads (Miltenyi) dan geupeuluwah lam media nyang lengkap ngon geupake TransAct (Miltenyi) seulama 2 minggu meunurot petunjuk pabriek. Sel-sel nyan geubi teudong seulama 5 uroe lam media nyang lengkap nyang na IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), lheuh nyan geurangsang lom ngon TransAct. Bak uroe keu 7, meunurot peutunyok pabriek, CD45 MicroBeads manusia (Miltenyi) geupake keu geupeukaya sel lam lhee putaran meuturot-turot. Sel-sel nyan geu aliquot keu analisis sitometri aliran (lagee nyang ka geujelaskan di ateuh), dan sijuta sel geu aliquot lhee goe keu analisis LC-MS/MS. Sampel-sampel nyan geuproses ngon LC-MS/MS lagee nyang ka geubri gamba di miyup nyoe. Kamoe meukira nilai metabolit nyang gadeh deungon jumlah ion 1.000. Tiëp-tiëp sampel dinormalisasi deungon jumlah ion total (TIC), diubah seucara logaritmik dan dinormalisasi seucara otomatis lam MetaboAnalystR sigohlom dianalisis.
Suspensi sel tunggal dari tiep-tiep pasien geu cair dan geu saring lewat filter 40 μm jeut keu media nyang lengkap (lagee nyang ka geu peugah di ateuh). Meunurot protokol pabriek, lhee putaran seleksi positif meuturot-turot ngon cara peumisah manik-manik magnet nyang geupake MicroBeads (Miltenyi) geupake keu geupeukaya sampel keu sel CD8+, CD4+ ngon CD45- (ateuh es). Singkat jih, sel-sel nyan disuspensi lom lam penyangga pengayaan sel (lagee nyang dijelaskan di ateuh) dan dihitong. Sel-sel nyan ji inkubasi ngen manik-manik CD8 manusia, manik-manik CD4 manusia atawa manik-manik CD45 manusia (Miltenyi) bak suhu 4°C seulama 15 minet, lheuh nyan ji rhah ngen penyangga pengayaan sel. Sampel nyan geujak rot kolom LS (Miltenyi), dan peucahan positif ngon negatif geukumpoi. Untuk geupeukureung durasi ngon geupeumaksimal langkah pemulihan sel, fraksi CD8 lheuh nyan geupake keu putaran keudua pengayaan CD4+, ngon fraksi CD4 geupake keu pengayaan CD45 selanjut jih. Jaga larutan nyan ateuh es seulama proses peumisah.
Untuk geupeusiap sampel untuk analisis metabolit, sel-sel nyan di rhah sige ngen larutan sira yang lupie lagee es, dan 1 ml metanol 80% ditamah keu tiep-tiep sampel, lheuh nyan di vortex dan dipeu beku lam nitrogen caer. Sampel nyan dipeulaku lhee siklus beku-cair dan disentrifugasi bak 14.000 rpm seulama 15 minet bak suhu 4°C. Supernatan nyang na metabolit nyan geu-uap sampoe thoe. Metabolit nyan dipeularut lom lam 50 μl asam formik 0,03%, diputar-putar untuk meujampu, lheuh nyan disentrifugasi untuk dipeugadeh putoh-putoh.
Ekstrak metabolit lagee nyang ka geujelaskan di ateuh. Pinah supernatan u dalam botol kromatografi cair nyang berkinerja tinggi keu penelitian metabolomik. Gunakan protokol pengobatan acak untuk merawat tiep-tiep sampel deungon jumlah sel nyang sama untuk mencegah efek batch. Kamoe peugot penilaian kualitatif metabolit global nyang ka geupeuteubiet seugolom jih bak Spektrometer Massa Kuadrupol Lhee AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analisis kromatografi ngon integrasi wilayah puncak geupeugot ngon geungui perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Biosistem Terapan SCIEX).
Hitongan ion 1000 dipakek untok memperkirakan nilai metabolit yang gadeh, dan TIC dari tiep sampel dipakek untok meuhitong luas puncak yang dinormalisasi dari tiep metabolit yang dideteksi untok dipeubetoi perubahan yang dipeuturi le analisis instrumental dari pemrosesan sampel. Lheueh TIC ka normal, MetaboAnalystR (51) (parameter lalai) geungui keu konversi logaritmik ngon skala gareh norma otomatis. Kamoe meupake PCA ngon paket R vegan keu peugot analisis eksploratif perbedaan metabolom antara jenis sampel, dan meupake analisis redundansi parsial keu meuanalisis pasien. Gunakan metode Ward untok peuget dendrogram peta suum untok mengumpulkan jarak Euclidean antar sampel. Kamoe meupake limma (52) bak kelimpahan metabolit standar untok mengidentifikasi metabolit nyang berlimpah secara berbeda di mandum jenis sel ngon lingkungan mikro. Untuk tapeusederhana penjelasan, kamoe pakek parameter rata-rata kelompok untuk tapeuteunte model, dan tapeutimang jenis sel lam lingkungan mikro seubagoe tiep-tiep kelompok (n = 6 kelompok); untuk tes signifikansi, kamoe peugot lhee boh pengukuran meu ulang-ulang keu tiep-tiep metabolit Untuk meuhindari replikasi palsu, pasien dipeutamong seubagoe rintangan lam desain limma. Untuk geupareksa perbedaan metabolit antara pasien nyang berbeda, kamoe menyesuaikan model limma termasuk pasien deungon cara nyang teutap. Kamoe meulaporkan signifikansi kontras nyang ka ditentukan awai antara jenis sel ngon lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Lheuh pengayaan kekuatan geupake Kit Peugadeh Sel Mate Miltenyi (>80% viabilitas), urutan transkriptom sel tunggal geupeuget bak total sampel asma ngon tumor nyang ka beku udep geupake protokol ekspresi gen 10x 5′. Limong kasus ngen tumor ngon ascites nyang cocok dianalisis, meskipun viabilitas nyang rendah dari saboh sampel tumor mencegah inklusi jih. Untuk meucapai le seleksi pasien, kamoe meugabongkan sampel tiep-tiep pasien lam jalur kontroler kromium 10x, dan menganalisis teumpat ascites dan tumor secara meupisah. Lheueh geu-urut [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ujong nyang meupasang (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 dan 41.378 bacaan per sel untuk tumor dan asma maseng-maseng]], kamoe menggunakan CellSNP dan Vireo (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP manusia umum (VCF) yang disediakan oleh GRCh38 ditugaskan identitas genotipe (status pasien close) (IBS), hana jitamong sel-sel nyang hana ditugaskan dan sel-sel nyang diidentifikasi seubagoe dupleks dan donor nyang cocok antara asma dan sampel tumor (54 Berdasarkan tugas nyoe, kamoe mempertahankan lhee kasus deungon representasi sel nyang melimpah lam tumor dan asma untuk analisis hilir (scCoran pactor nyoe dan)6. meuhase 6975 sel (2792 ngon 4183 sel dari tumor ngon ascites, maseng-maseng) keu analisis Kamoe meupakek igraph (57) Pengelompokan Louvain dari jaringan tetangga terdekat bersama (SNN) berdasarkan jarak gen Jaccard keu sel kelompok secara manual ekspresi annota. dan geu visualisasikan ngon t-SNE Sel T sitotoksik geu definisikan le ekspresi CD8A ngon GZMA, hana termasuk subkluster ngon ekspresi protein ribosom nyang rendah, termasuk penyematan t-SNE awaknyan, jeut geu kontrol ekspresi tumpang tindeh antara sel imun.
PBMC dipisah dari produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) ngen sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + geuisolasi dari PBMC ngon geupake manik-manik CD3 (Miltenyi). Bak na atawa hana MNA, sel CD3+ geuaktivasi ngon CD3 nyang meuikat bak pelat (5μg/ml), CD28 nyang larut (3μg/ml) ngon IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Bak uroe akhe ekspansi, kelangsungan udep (Pewarna Kelangsungan Hidup Tetap eFluor450, eBiosains) ngon proliferasi (123hitung eBeads, Termo Fisher Ilmiah) geuevaluasi ngon sitometri aliran. Evaluasi fungsi efektor ngon cara merangsang sel ngon PMA (20 ng/ml) ngon ionomisin (1μg/ml) ngon GolgiStop seulama 4 jeum, ngon memantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ngon TNFore-PerCP. (mab11, bd). Merangsang sel qPCR ngon ChIP ngon PMA (20 ng/ml) ngon ionomisin (1μg/ml) seulama 4 jeum. Supernatan ELISA geukumpoi seugohlom ngon lheuh stimulasi ngon PMA (20 ng/ml) ngon ionomisin (1 μg/ml) seulama 4 jeum.
Ikot protokol pabriek untuk isolasi RNA pakek RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Pakèk QIAGEN (QIAGEN) keu peuhomogen sampel. Gunakan RNA keu cDNA kit nyang berkapasitas tinggi (Thermo Fisher Ilmiah) keu sintesis DNA pelengkap (cDNA). Gunakan Campuran Induk Lanjutan Cepat TaqMan (Thermo Fisher Scientific) untuk mengukur ekspresi gen (meunurot protokol pabrikan) dengan probe berikut: gliseraldehida-3-fosfat dari Hidrogen (GAPDH)] dan Hs1010726_m1 (SLC22A2). Sampel nyan dipeujak bak sistem PCR watee nyata StepOnePlus (Biosistem Terapan) (Biosistem Terapan) lam pelat reaksi 96-sumur optik bagah MicroAmp (Biosistem Terapan) ngen pilem optik MicroAmp. Nilai Ct peu mantong nyang leubeh dari 35 geuanggap di ateuh ambang batah deteksi dan geutanda hana jeuet geudeteksi.
Peulaku ChIP lagee nyang ka geubri gamba dilee (58). Singkat haba, sel-sel nyan geurawat ngon formaldehida (konsentrasi akhe 1,42%) dan geu inkubasi bak suhu ruangan seulama 10 minet. Gunakan penyangga bengkak nyang ditambah (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM dan NP-40 0,1%) ateuh es seulama 10 minet, lheuh nyan disuspensi lom lam penyangga imunopresipitasi lagee nyang ka dipeugah (58 ). Sampel nyan lheuh nyan disonikasi ngon siklus-siklus lagee nyoe: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) ngon watee statis 40 detik. Inkubasi antibodi imunoglobulin G (Teknologi Pensinyalan Sel; 1 μl), histon H3 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) ngon SP1 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl) ngon sampel bak 4°CCn Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) ngen sampel bak suhu 4°C ngen geukoh lembut seulama 1 jeum, lheuh nyan geupake manik-manik chelex (Bio-Rad) untuk geupeukaya DNA, dan geupake proteinase K (Thermo Fisher) untuk pencernaan protein. Promotor TNFα jiteumee ngon PCR: keu ukeu, GGG TAT CCT TGA TGC TGT TGT; seubalek jih, GTG CCA ACA AKTA GCC TTT ATA TG (produk 207 bp). Gambar-gambar nyan jipeugot le Image Lab (Bio-Rad) dan ji uko ngon ji pakek perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel geukumpoi lage nyang ka geujelaskan di ateuh. Penentuan nyan geupeugot meunurot prosedur pabriek alat ELISA TNFα manusia (Invitrogen), alat ELISA IL-2 manusia (Invitrogen) ngon alat ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Meunurot protokol pabriek, supernatan nyan geu encerkan 1:100 untuk geu deteksi TNFα ngon IL-2, dan 1:3 untuk geu deteksi IFN-γ. Gunakan Pembaca Multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) keu geu uko daya serap bak 450 nm.
PBMC dipisah dari produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) ngen sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + geuisolasi dari PBMC ngon geupake manik-manik CD3 (Miltenyi). Bak na atawa hana MNA, sel CD3+ geuaktifkan ngon CD3 nyang meuikat bak pelat (5μg/ml), CD28 nyang larut (3μg/ml) ngon IL-2 (300 U/ml; Proleukin) seulama 3 uroe. Lheueh 3 uroe, sel-sel nyan geukumpoi dan geuraseu ngon saline 0,9%, dan pelet nyan geubekukan. Hitongan sel geupeugot ngon cara sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) ngon geungui 123hitongan eBeads.
Ekstrak metabolit lagee nyang ka geujelaskan di ateuh. Ekstrak nyang ka thoe nyan geu rekonstitusi bak konsentrasi 4000 setara sel/μl. Analisa sampel ngon kromatografi fase teubalek (1290 Infinity II, Teknologi Agilent, Santa Clara, CA) ngon kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori 120-Å; #186008500). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), di pat ionisasi elektrosemprotan beroperasi lam mode positif. Fase mobile A nakeuh 0,1% asam formik (lam H2O), fase mobile B nakeuh 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC nakeuh 0 sampoe 2 minet keu 100% A, 2 sampoe 7,1 minet keu 99% B, dan 7,1 sampoe 8 minet keu 99% B. Lheueh nyan tapeuseimbang lom kolom ngon fase mobile A deungon laju aliran 0,6 ml/min seulama 3 minet. . Laju aliran jih 0,4ml/min, ngon kama kolom nyan geupeusuum sampoe 50°C. Gunakan standar kimia murni MNA (M320995, Perusahaan Kimia Penelitian Toronto, York Utara, Ontario, Kanada) untuk neutetapkan watee peutheun (RT) ngon transformasi (RT = 0,882 minet, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→1372). Watee ke lhee transisi nyan teujadi bak watee retensi nyang beutoi, transisi 1 dipakek untuk kuantifikasi untuk memastikan spesifitas. Kurva standar MNA (Perusahaan Kimia Penelitian Toronto) geuhasekan le nam boh pengenceran serial larutan saham (1 mg/ml) untuk meuteumee standar 0,1, 1,0, 10 dan 100 ng/ml dan 1,0 dan 10μg/ml cair maseng-maseng. Batas deteksi nakeuh 1 ng/ml, ngon tanggapan linier nakeuh antara 10 ng/ml ngon 10μg/ml. Tiëp-tiëp injeksi dua mikroliter sampel ngon standar geungui keu analisis LC/MS, ngon sampel kontrol mutu campuran geujalankan tiëp lapan injeksi keu geupeupasti stabilitas platform analisis. Respon MNA dari mandum sampel sel nyang dipeulaku ngen MNA na lam rentang linier assay. Analisis data geupeugot ngon geungui perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruksi αFR-CAR generasi keudua geucok dari Song et al. (59). Singkat jih, konstruksi nyan mengandung asoe lagee nyoe: urutan pemimpin CD8a, fragmen variabel rante tunggal spesifik αFR manusia, engsel CD8a ngon wilayah transmembran, domain intraseluler CD27 ngon domain intraseluler CD3z. Urutan CAR nyang leungkap ji sintesis le GenScript, ngon leuh nyan ji kloning jeut keu vektor ekspresi lentivirus generasi keudua di hulu kaset ekspresi GFP nyang ji pakek untuk ji evaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus nyan jipeugot ngon cara transfeksi sel HEK293T [Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC); ji tumbuh lam media Eagle nyang ka ji modifikasi le Dulbecco nyang na 10% serum janin sapi (FBS) ngon 1% PenStrep, ngon ji pakek vektor CAR-GFP ngon Plasmid kemasan (pspax2 ngon pMD2.G, Addgene) ji pakek amina lipofeksi (Sigma-Aldrich). Supernatan nyang na virus nyan jikumpoi 48 ngon 72 jeum lheuh ji transfeksi, ji saring, ngon ji konsentrasi ngen ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus nyang ka ji pekat bak suhu -80°C sampoe ji transduksi.
PBMC geu pisahkan dari produk pemisahan leukosit donor nyang sehat (Teknologi STEMCELL) ngen sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Gunakan mikromanik CD8 seleksi positif (Miltenyi) untuk mengisolasi sel CD8+ dari PBMC. Merangsang sel T ngon TransAct (Miltenyi) dan lam media TexMACS [Miltenyi; ditambah ngon 3% serum manusia nyang hana diaktifkan le suum, 1% PenStrep ngon IL-2 (300 U/ml)]. Dua ploh peut jeum lheuh stimulasi, sel T ji transduksi ngen lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 sampoe 3 uroe lheuh transduksi bak Cytek Aurora (bak FSC (Penyebaran Ukeu)/SSC (Penyebaran Samping), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel-sel untuk menunjukkan efisiensi transduksi setidak jih 30% .
Sel CAR-T geubiakkan seulama 24 jeum lam Immunocult (Teknologi STEM; geutamah ngon 1% PenStrep) lam kondisi lagee nyoe: hana geurawat, geurawat ngon adenosin 250 μM atawa MNA 10 mM. Lheueh praperawatan, sel CAR-T geuraseu ngon PBS dan geupeugabong ngon 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; lam media McCoy 5A (Sigma-Aldrich) nyang ditambah ngon 10% FBS ngon 1% PenStrep bak 10: Rasio efektor ngon target 1 dipeukuat lam lhee boh lam media Imunokult nyang ditambah. Sel SK-OV-3 ngon sel SK-OV-3 nyang geu lisi ngon saponin digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) geu pakek seubagoe kontrol negatif ngon positif, maseng-maseng. Lheueh 24 jeum ko-kultivasi, supernatan geukumpoi dan laktat dehidrogenase (LDH) geu uko meunurot peutunyok pabriek (Kit Assay Sitotoksisitas LDH Glo, Promega). Supernatan LDH geu encerkan 1:50 lam penyangga LDH. Persentase pembunuhan geu uko deungon rumus lagee nyoe: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimum x 100%, dimana persentase koreksi = ko-kultur-sel T mantong, dan tingkat pembunuhan maksimum = kontrol positif-kontrol negatif.
Lagee nyang ka geubri gamba lam teks atawa bahan ngon cara, geungui GraphPad Prism 8, Microsoft Excel atawa R v3.6.0 keu analisis statistik. Meunyoe le sampel nyang dikumpoi dari pasien nyang saban (lagee ascites ngon tumor), kamoe pakek tes t nyang meupasang atawa kamoe peutamong pasien seubagoe efek acak lam model linier atawa umum nyang sesuai. Untuk analisis metabolomik, tes kepentingan nyan dipeuget lam lhee boh.
Keu bahan tambahan keu tulesan nyoe, neukalön bak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Nyoë nakeuh saboh artikel akses teubuka nyang geusebarkan dimiyub syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, nyang meumungkén keu geungui, geusebarkan ngon geupeureproduksi lam media peu mantong, asai geungui akhé kon keu keuntongan komersial ngon premis jih nakeuh bahwa karya asli nyan beutôi. Rujokan.
Catatan: Kamoe hanya meulakee droeneuh neubri alamat email droeneuh supaya ureung nyang droeneuh rekomendasikan keu laman nyan jiteupeu bahwa droeneuh neumeuheut awak nyan kalon email nyan dan bahwa email nyan kon spam. Kamoe hana akan meureukam alamat email sapeu.
Soalan nyoe geungui keu geutes peuë droëneuh nakeuh ureuëng tamong ngon geucegah otomatis neukirém spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. (Rusel G. Jones), Pineas T. Hamilton (Pineas T.
MNA berkontribusi bak penekanan imun sel T ngon mewakili target imunoterapi potensial keu pengobatan kanker manusia.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. (Rusel G. Jones), Pineas T. Hamilton (Pineas T.
MNA berkontribusi bak penekanan imun sel T ngon mewakili target imunoterapi potensial keu pengobatan kanker manusia.
©2021 Asosiasi Amerika keu Kemajuan Sains. mandum hak geukeubah. AAAS nakeuh mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kemajuan Sains ISSN 2375-2548.