Penyortiran protein bak jalur sekresi nyan penteng keu mempertahankan kompartementalisasi sel ngon homeostasis. Selaen penyortiran nyang dimediasi cangkang, peran lipid lam penyortiran kinesin lam proses transportasi sekresi nakeuh pertanyaan dasar nyang ka trep nyang golom terjawab. Di sinoe, kamoe peuget pencitraan wate nyata resolusi tinggi multiwarna simultan 3D untok meubuktikan lam vivo bahwa protein imobilisasi glikosilfosfatidilinositol nyang baroe disintesis ngen moieties lipid keramida nyang that panyang dikelompokkan ngon diklasifikasikan jeut keu endoplasma khusus nyang berbeda dari situs teubit transmbram nyang berbida. Seulaen nyan, kamoe meutunyok bahwa panyang rante seramida lam membran retikulum endoplasma kritis keu selektifitas penyortiran nyoe. Studi kamoe geubri bukti in vivo langsong phon keu mengklasifikasikan kargo protein berdasarkan panyang rante lipid keu situs ekspor selektif lam jalur sekresi.
Bak sel eukariotik,protein nyang disintesis bak retikulum endoplasma (ER) kemudian diurutkan selama transportasi melalui jalur sekresi keu ikirem ke tujuan seluler nyang sesuai. Selaen penyortiran nyang dimediasi lapisan, kaleuh trep berspekulasi bahawa lipid terteuntu cit jeuet berfungsi seubagoe titek teubiet selektif deungon mengelompokkan jih keu domain membran terteuntu nyang protein terteuntu. Namun, manteng kureung bukti in vivo langsong keu geubuktikan kemungkenan mekanisme berbasis lipid nyoe. Untuk menyelesaikan masalah dasar nyoe, kamoe meurunoe lam ragi kiban protein berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) secara berbeda diekspor dari ER. GPI-AP nakeuh macam-macam protein permukaan sel nyang meuhubong ngon lipid ( 6, 7). GPI-AP nakeuh protein nyang disekresikan nyang meuleukat bak lembaran lua membran plasma melalui bagian glikolipid (jangkar GPI). Awak nyan jiteurimong jangkar GPI seubagoe modifikasi pasca-translasi konservatif lam lumen ER (8). Lheueh meuleukat, GPI-AP lewat aparat Golgi (5, 9) dari ER u membran plasma. Na jangkar GPI menyebabkan GPI-AP diangkut secara teupisah dari protein nyang disekresikan transmembran (termasuk protein membran plasma laen jih) bak sepanyang jalur sekresi (5, 9, 10). Lam sel ragi, GPI-AP dipisahkan dari protein laen nyang disekresikan lam retikulum endoplasma, lheuh nyan dikemas lam vesikel unik nyang dibungkus oleh kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Determinan proses klasifikasi nyoe lam proses ekspor ER hana jeulaih, tapi na spekulasi bahwa mekanisme nyoe mungken memerlukan lipid, terutama remodeling struktural bagian lipid jangkar GPI (5, 8). Lam ragi, remodeling lipid GPI dimulai segera lheuh GPI meuleukat, ngon lam le kasus, nyan menyebabkan seramida meuikat bak asam lemak jenuh rante panyang 26 karbon (C26:0) (11, 12). C26 ceramide nakeuh seramida utama nyang jipeuhase le sel ragi seulama nyoe. Nyan disintesis lam ER dan sebagian rayeuk di ekspor u aparat Golgi melalui vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP seucara khusus memerlukan sintesis keramida nyang meulanjot (14, 15), ngon bak giliran jih, konversi keramida jeut inositol fosfat keramida (IPC) lam aparat Golgi bergantung bak sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika deungon membran buatan kaleuh meugisa bahawa keramida rante asil nyang that panyang jeuet meugabong untok membentuk domain nyang meuato deungon sipheuet fisik nyang unik (17, 18). Data nyoe meuakibatkan hipotesis bahawa seramida C26 ngon GPI-AP deungon seramida C26 geupakeek sipheuet fisik gobnyan untok meugabong jeuet keu daerah atawa daerah nyang teratur lam lingkungan lipid membran ER nyang relatif karu. Terutama terdiri dari gliserolipid yang paneuk dan hana jeulah (C16:1 dan C18:1) (19, 20). Daerah-daerah nyoe akan secara selektif difokuskan bak situs teubiet ER (ERES) tertentu, dimana GPI-AP berbasis seramida dan seramida jeut diangkut bersama ke Golgi lam vesikel COPII yang sama yang didedikasikan (5).
Lam penelitian nyoe, kamoe ka langsong geu uji mekanisme berbasis lipid nyoe deungon geu pakek mikroskopi pencitraan watee nyata konfokal super-resolusi (SCLIM), nyang merupakan teknik mikroskop canggih nyang jeut secara bersamaan geu amati protein nyang geubri label fluoresen sel lhee warna ngon lhee dimensi na resolusi tinggi lipelu (3D) (21, 22).
Phon that kamoe meuterapkan teknologi SCLIM keu meudefinisikan leubeh lanjot kiban GPI-AP normal ngen kelompok seramida C26 nyang disaring dari protein nyang disekresikan transmembran aleuh meninggalkan ER di S. cerevisiae. Untuk geupareksa klasifikasi ER, kamoe geupake sistem genetik nyang jeut langsong geuvisualisasikan kargo nyang baroe geusintesis nyang tamong lam ERES lam vivo (7, 23). Seubagoe kargo, kamoe memilih GPI-AP Gas1 berbasis keramida C26 nyang geubri label ngen protein fluoresen ijo (GFP) ngon protein nyang geusekresikan transmembran Mid2 nyang geubri label ngen protein fluoresen inframerah toe (iRFP), kedua jih geutargetkan membran plasma (24-26). Lam mutan peka suhu sec31-1, dua kargo nyoe geu ekspresikan diyub promotor induksi galaktosa ngon penanda ERES konstitutif. Bak suhu ekstrim (37°C), kareuna mutasi sec31-1 mempengaruhi fungsi komponen lapisan COPII Sec31 untuk menghambat perkecambahan COPII dan ekspor ER, kargo yang baroe disintesis menumpuk bak ER (23). Lheuh ji peu leupie bak suhu miyup (24°C), sel mutan sec31-1 ka puleh dari daerah sekresi, dan kargo sintetis baro nyang ka meukumpol mulai ji ekspor dari ER. Visualisasi CLIM geupeuleumah bahwa sebagian rayeuk Gas1-GFP ngon Mid2-iRFP nyang baroe disintesis mantong meutamah lam ER sel mutan sec31-1 lheuh inkubasi bak suhu 37°C lheuh nyan geupeuleupah bak suhu 24°C seulama 5 minet (Gambar 1). Kareuna Mid2-iRFP tersebar bak mandum membran ER, dan Gas1-GFP terkonsentrasi dan terkumpul di daerah membran ER yang hana berkelanjutan, distribusi awaknyan sama sekali berbeda (Gambar 1, A sampoe C dan Film S1). Seulaen nyan, lagee nyang deuh bak Gambar 1D, gugus Gas1-GFP hana Mid2-iRFP. Hase nyoe menunjukkan bahwa GPI-AP ngon protein transmembran dipisahkan jeut keu daerah membran ER nyang berbeda bak awai. Gugus Gas1-GFP nyan toe ngon ERES terteunte nyang geubri label ngon protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E ngon F, ngon filem S1) (23).
Sel sec31-1 mengekspresikan sekresi yang diinduksi oleh galaktosa, keramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ijo) dan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES Konstruktif nyoe adalah Sec13-mCherry minit, geupinah u 24°C, dan geucitrakan le SCLIM 5 minit lheuh nyan. (A sampoe C) geupeuleumah gamba 2D nyang meugabong atawa tunggal nyang meuwakili dari saboh bidang (A), gamba proyeksi 2D dari 10 bagian-z (B) atawa gamba belahan sel 3D dari kargo ngon penanda ERES (C). Skala bar 1μm (A dan B). Satuan skala nakeuh 0,551μm (C). Gas1-GFP jiteumee bak wilayah atawa gugus ER nyang diskrit, seudangkan Mid2-iRFP jiteumee ngon jisebarkan bak mandum membran ER (C). (D) Grafik nyan geupeuleumah intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP ngon Mid2-iRFP lam gugus Gas1-GFP di seupanyang gareh panah puteh (wi). AU, satuan sewenang-wenang. (E ngon F) mewakili gamba 3D nyang meugabongkan barang ngon tanda ERES. Gugusan Gas1-GFP jiteumee toe ngon ERES nyang spesifik. Satuan skala jih nakeuh 0,551μm. (F) Panah padat puteh nyan tanda gugus Gas1-GFP nyang meukaet ngon ERES. Panel teungoh ngon uneun geupeuleumah gamba 3D nyang ka geupeurayeuk nyang ka geupeugabong ngon pandangan nyang ka geuputa dari gugus Gas1-GFP nyang ka geupiléh.
Hubungan spasial nyang toe antara kluster Gas1-GFP ngon ERES tertentu menunjukkan bahwa Gas1-GFP jeut jitamong lam ERES selektif, nyang berbeda ngon selektifitas nyang dipakek le Mid2-iRFP untuk jitinggai ER. Untuk geuhadapi kemungkenan nyoe, kamoe meukira rasio ERES hanya untuk saboh atawa dua barang (Gambar 2, A sampoe C). Kamoe meuteumee bahwa sebagian rayeuk ERES (70%) na saboh jenis kargo mantong. Gambar di miyup Gambar 2C menunjukkan dua contoh khas ERES hanya Gas1-GFP (Gambar 1) atau hanya Mid2-iRFP (Gambar 2). Seubalek jih, kira-kira 20% dari ERES na dua boh kargo nyang tumpang tindeh di wilayah nyang saban. Diteumee bahwa na padum-padum boh ERES (10%) nyang na dua boh jeuneh kargo, tapi awak nyan diisolasi di daerah nyang jeulaih beda. Kareuna nyan, analisis statistik nyoe menunjukkan bahwa lheuh ER diekspor, GPI-AP Gas1-GFP dan kargo transmembran Mid2-iRFP dibagi jeut keu ERES nyang berbeda (Gambar 2D). Efisiensi penyortiran nyoe that konsisten ngon analisis biokimia seugolom jih (6) ngon penentuan morfologis (7). Jeut cit ta amati tingkah laku kargo nyang dikarantina nyang tamong u ERES (Gambar 2E dan Film S2). Gambar 2E menunjukkan bahwa hanya sebagian ubeut dari Gas1-GFP (panel 3) atau Mid2-iRFP (panel 4) yang tamong lam ERES dari saboh sisi dan terbatas lam daerah yang diskrit. Panel 5 dari Gambar 2E menunjukkan bahwa Gas1-GFP dan Mid2-iRFP kadang-kadang diteumee di ERES yang sama, tapi awaknyan tamong dari sisi yang berbeda dan terkonsentrasi di daerah yang teupisah yang mungken mewakili vesikel COPII yang berbeda. Kamoe pih meukonfirmasi bahwa pemisahan ngon klasifikasi nyang diamati dari GPI-AP Gas1 berbasis keramida C26 seubagoe ERES selektif nyan spesifik kareuna kargo sekresi transmembran laen, protein membran plasma nyang ditanda GFP Axl2 (27 ), menunjukkan perilaku nyang sama ngon Mid2-iRFP. (Gambar S1 ngon Film S3). Axl2-GFP nyang baroe disintesis nyan didistribusikan melalui membran ER lagee Mid2-iRFP (Gambar S1, A ngon B), ngon bersama-sama ngon Mid2-iRFP bak sebagian rayeuk ERES (Gambar S1, B sampoe D). Panel 1 dan 2 dari Gambar 1. S1C menunjukkan dua contoh khas ERES dimana dua kargo transmembran tumpang tindeh. Lam hai-hai nyoe, bandua barang nyan tamong lam ERES beusama-sama (Gambar S1E, Panel 3 dan Film S3).
Sel sec31-1 nyang jipeugah sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ijo) ngon Mid2-iRFP (TMP, biru) ngon pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) jipeuduek bak suhu 37 Lheueh ji inkubasi sekresi sampoe 30 minet. blok, dan gamba ngon SCLIM lheuh 20 minet. (A sampoe C) Gambar proyeksi 2D perwakilan (A; batang skala, 1μm) atau gamba belahan sel 3D (B ngen C; satuan skala, 0,456μm) dari kargo ngen 10 bagian z yeng ditanda le ERES. Panel miyueb bak (B) ngon panel bak (C) geupeuleumah gamba nyang ka geuproses keu geupeuleumah mantong barang nyang na lam ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) ngon Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah teubuka: ERES hanya jiba saboh boh muatan (1 sampoe 4). Panah abu-abu: ERES na kargo nyang ka teupisah (5). Panah padat puteh: ERES nyang meuasoe kargo nyang na di teumpat nyang saban. Di miyup nyoe: ERES tunggal nyang geupiléh nyan na Gas1-GFP (1) atawa Mid2-iRFP (2) mantong. Batang skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf nyang geugamba lam (C). Rata-rata persentase ERES nyang na saboh kargo mantong (Gas1-GFP atawa Mid2-iRFP), kargo nyang teupisah ngon kargo nyang tumpang tindeh. Lam lhee percobaan independen, n=432 lam 54 sel. Bar keusalahan = SD. Uji t hana meupasang dua ekor. *** p = 0,0002 boh. (E) Gambar 3D ERES nyang ka geupiléh dari kargo nyang ka dikarantina nyang geutanda ngon (C). Gas1-GFP (hijo) (3) atawa Mid2-iRFP (biru) (4) jitamong lam ERES (magenta) dari saboh blah dan teubatah bak wilayah ubeut lam ERES. Kadang-kadang, bandua jeunèh kargo nyan jitamong lam ERES nyang saban (5) dari blah nyang saban dan teubatah bak saboh wilayah nyang terisolasi lam ERES. Batang skala, 100 nm.
Seulanjot jih, kamoe meutes hipotesis bahwa keramida rante asil panyang (C26) nyang na lam membran ER mendorong pengelompokan ngon penyortiran spesifik Gas1 jeut keu ERES selektif. Keu nyoe, kamoe pakek strain ragi GhLag1 nyang ka geumodifikasi, dipat dua boh sintesis seramida endogen Lag1 ngon Lac1 geugantoe le GhLag1 (homolog Lag1 dari kapas), nyang geuhasilkan strain ragi ngon strain Ceramide membran sel nyang leubeh paneuk dari tipe liar (Gambar 3A) (2). Analisis spektrometri massa (MS) geupeuleumah bahwa bak strain tipe liar, 95% dari total keramida nyan keramida rante nyang that panyang (C26), seudangkan bak GhLag1, 85% dari keramida nyan that panyang (C18 ngon C16). ), cuma 2% dari keramida nyang that panyang (C26) keramida rante. Meskipun seramida C18 ngon C16 nakeuh seramida utama nyang jiteumee lam membran GhLag1 seulama nyoe, analisis MS cit jikonfirmasi bahwa jangkar GPI Gas1-GFP nyang jiekspresikan lam strain GhLag1 mengandung seramida C26, nyang sebandeng ngon lipid tipe liar. Kualitas jih saban (Gbr. 3A) (26). Kareuna nyan, nyoe berarti bahwa enzim remodeling keramida Cwh43 that selektif keu keramida C26, lagee nyang dipeuleumah bak Gambar 26, jih leubeh galak meugabongkan jangkar GPI dari sejumlah ubit keramida C26 lam strain GhLag1. S2 (29). Meskipun lagee nyan, membran sel GhLag1 bak dasar jih hanya mengandung seramida C18-C16, sedangkan Gas1-GFP mantong na seramida C26. Fakta nyoe jeut keu strain nyoe jeut keu alat ideal untuk secara khusus menyelesaikan masalah panyang rante asil seramida membran di ER. Peran hipotetis glah ngon penyortiran. Kemudian, phon that kamoe meurunoe kemampuan C26 Gas1-GFP untuk meutumpok lam gugus-gugus di GhLag1 ngon alel mutan sec31-1 nyang sensitif keu suhu melalui mikroskopi fluoresensi konvensional, dipat hanya rante panyang (C18-C16) nyang na lam membran ER Ceramide (Gambar 3). Kamoe meu-amati bahwa bak sec31-1, sebagian rayeuk Gas1-GFP terkonsentrasi lam rumpun, sedangkan Gas1-GFP bak sec31-1 GhLag1 deungon membran ER seramida panyang (C18-C16) panyang terutama hana berkelompok dan tersebar di Lam mandum membran ER. Teupat jih, kareuna clustering berbasis seramida C26 na hubungan erat ngon ERES spesifik (Gambar 1), kamoe selanjut jih menyelidiki peu proses nyoe mungken cit melibatkan fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP geupake sistem COPII khusus keu ekspor ER, nyang secara aktif geuatoe le remodeling struktural Ted1 nibak bagian glikan jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan kemudian dituri oleh kompleks p24 reseptor kargo transmembran, nyang bak giliran jih secara selektif merekrut Lst1, nyang merupakan isoform spesifik dari subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, membentuk Vesikel COPII nyang kaya GPI-AP nyang diperlukan. Oleh karena nyan, kamoe meubangun mutan ganda nyang meugabongkan penghapusan protein tunggal nyoe (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glikan Ted1 ngon subunit COPII spesifik Lst1) ngon strain mutan sec31-1, ngon meurunoe awaknyan Peu keuh mungken untuk membentuk Gasster GFP1-c3). Kamoe meu-amati bahwa bak sec31-1emp24Δ ngon sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutama hana meugumpôi ngon tersebar di seluroh membran ER, lagee nyang ka lheueh deuh bak sec31-1 GhLag1, sedangkan bak sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP1 Lagee sec3. Hase nyoe menunjukkan bahwa selain na C26 ceramide lam membran ER, clustering Gas1-GFP pih perle meuikat bak kompleks p24, dan hana perle rekrutmen Lst1 spesifik. Teuma, kamoe meueksplorasi kemungkenan bahwa panyang rante seramida lam membran ER jeuet mengatue ikatan Gas1-GFP keu p24. Namun, kamoe meuteumee bahwa na ceramida C18-C16 lam membran hana mempengaruhi GPI-glikan nyang direkonstruksi le kompleks p24 (Gambar S3 dan S4, A dan B) atawa meuikat bak GPI-AP dan mengekspor GPI-AP. ek. Rekrut subtipe COPII Lst1 (Gambar S4C). Oleh kareuna nyan, pengelompokan nyang bergantung bak seramida C26 hana memerlukan interaksi protein deungon mekanisme protein ekspor ER nyang berbida, teutapi mendukong mekanisme penyortiran alternatif nyang ditulak uleh panyang lipid. Teuma, kamoe meuanalisa peu panyang rante asil seramida lam membran ER nyan peunteng keu klasifikasi efektif Gas1-GFP seubagoe ERES selektif. Kareuna Gas1 lam strain GhLag1 ngon seramida rante paneuk jitinggai ER dan jitamong lam membran plasma (Gambar S5), kamoe peucaya bahwa meunyoe penyortiran nyan jidorong le panyang rante asil seramida, Gas1 lam strain GhLag1 jeut ji arahkan lom dan ji silang. Barang ERES ngon membran nyang saban.
(A) Membran sel GhLag1 terutama mengandung seramida C18-C16 nyang leubeh paneuk, sedangkan jangkar GPI Gas1-GFP mantong na IPC C26 nyang sama ngon sel tipe liar. Di ateuh: analisis panyang rante asil seramida lam membran sel tipe liar (Wt) ngon strain GhLag1p ngon spektrometri massa (MS). Data nyan mewakili persentase dari total keramida. Rata-rata dari lhee boh eksperimen independen. Bar keusalahan = SD. Uji t hana meupasang dua ekor. **** P <0,0001 nyan. Panel miyueb: Analisis MS panyang rante asil IPC nyang na lam jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) nyang diekspresikan lam strain tipe liar ngon GhLag1p. Data nyan mewakili persentase dari total sinyal IPC. Rata-rata dari limong eksperimen independen. Bar keusalahan = SD. Uji t hana meupasang dua ekor. ns, hana peunteng. P = 0,9134 nyan. (B) Mikrograf fluoresensi sel 31-1, 31-1 GhLag1, 31-1emp24Δ, 31-1ted1Δ dan 31-1lst1Δ sel yang mengekspresikan Gas1-GFP yang diinduksi oleh galaktosa diinkubasi pada suhu 30°C dan pers3 minutes. lheuh 24°C. Panah puteh: Gugusan ER Gas1-GFP. Panah teubuka: Gas1-GFP nyang hana meugumpôi tersebar bak mandum membran ER, geupeuleumah pewarnaan encin inti nyang khas ER. Batang skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf nyang geugamba lam (B). Rata-rata persentase sel ngen struktur Gas1-GFP nyang bertitik. Lam lhee boh percobaan independen, n≥300 sel. Bar keusalahan = SD. Uji t hana meupasang dua ekor. **** P <0,0001 nyan.
Untuk langsong tapeuseuleusoe masalah nyoe, kamoe peugot visualisasi SCLIM Gas1-GFP ngon Mid2-iRFP lam GhLag1 ngon alel mutan sec31-1 nyang sensitif keu suhu (Gambar 4 ngon Film S4). Lheueh ER geupeutheun bak suhu 37°C ngon lheuh nyan geupeuleupah bak suhu 24°C, sebagian rayeuk Gas1-GFP nyang baroe geusintesis hana geukelompokkan ngon geusebarkan bak mandum membran ER, lagee nyang geuamati le mikroskop konvensional (Gambar 4, A ngon B ). Seulaen nyan, persentase nyang rayeuk dari ERES (67%) mencakup dua boh jenis kargo nyang bersama-sama di dalam jih (Gambar 4D). Panel 1 ngon 2 nibak Gambar 4C geupeuleumah dua boh contoh khas ERES ngon Gas1-GFP ngon Mid2-GFP nyang tumpang tindeh. Seulaen nyan, bandua barang nyan direkrut u dalam ERES nyang sama (Gambar 4E, panel 3 dan film S4). Kareuna nyan, hasee kamoe menunjukkan bahwa panyang rantai asil seramida lam membran ER nakeuh penentu peunteng agregasi ngon klasifikasi protein ER.
Sel GhLag1 Sec31-1 nyang geupeuleumah sekresi nyang geu induksi le galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ijo) ngon Mid2-iRFP (TMP, biru) ngon Sec13-mCherry nyang geubri label ERES konstitutif (ERES, magenta) geu inkubasi bak suhu 37°C. Lanjutkan seulama 30 minet, peutron u 24°C untuk geupeuleupah sekresi, dan gamba ngon SCLIM lheuh 20 minet. (A sampoe C) Gambar proyeksi 2D perwakilan (A; batang skala, 1μm) atau gamba belahan sel 3D (B ngen C; satuan skala, 0,45μm) dari 10 bagian z yeng ditanda le kargo ngen ERES. Panel miyueb bak (B) ngon panel bak (C) geupeuleumah gamba nyang ka geuproses keu geupeuleumah mantong barang nyang na lam ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) ngon Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah nyang meuasoe puteh: ERES, barang tumpang tindeh. Panah teubuka: ERES na saboh barang mantong. Panel miyueb: ERES nyang dipileh na barang tumpang tindeh (1 dan 2) nyang ditandai lam (C). Batang skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf nyang geugamba lam (C). Lam unit GhLag1 sec31-1 ngon sec31-1, saboh mantong kargo (Gas1-GFP atawa Mid2-iRFP) nyang jitamong, ngon persentase rata-rata ERES keu kargo nyang terisolasi ngon kargo nyang tumpang tindeh. Lam lhee boh percobaan independen, n = 432 lam 54 boh sel (detik31-1) ngon n = 430 lam 47 boh sel (detik31-1 GhLag1). Bar keusalahan = SD. Uji t hana meupasang dua ekor. *** P = 0,0002 (detik31-1) dan ** P = 0,0031 (detik31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D ERES nyang ka geupiléh deungon kargo nyang tumpang tindeh (3) nyang geutanda lam (C). Gas1-GFP (hijo) ngon Mid2-iRFP (biru) jipeurab ERES (magenta) dari sisi nyang saban ngon tinggai di wilayah nyang saban nyang teubatah ERES. Batang skala, 100 nm.
Studi nyoe geubri bukti langsong lam vivo bahwa kargo protein berbasis lipid diklasifikasikan jeut keu situs ekspor selektif bak jalur sekresi, ngon mengungkapkan penteng jih panyang rantai asil keu selektifitas klasifikasi. Deungon geupake teknik mikroskop nyang kuat ngon canggih nyang geukheun SCLIM, kamoe menunjukkan Gas1-GFP nyang baroe disintesis (membran plasma utama GPI-AP ngon bagian lipid keramida rantai asil (C26) nyang that panyang) lam ragi ) Daerah-daerah nyang meugumpôi lam protein transmbrame diskrit nyang tersebar melalui ES nyang tersebar ngon ES nyang tersebar. membran ER nyang (Gambar 1). Seulaen nyan, dua boh jeuneh barang nyoe jitamong lam ERES nyang beda seucara selektif (Gambar 2). Panyang rante asil seramida seluler lam membran dipeukureng dari C26 jeut keu C18-C16, gugus Gas1-GFP terganggu keu wilayah ER nyang diskrit, ngon Gas1-GFP dirute ulang untuk meninggalkan ER ngon protein transmembran melalui ERES nyang sama (Gambar 3 ngon Gambar 3). 4).
Meskipun GPI-AP menggunakan mekanisme protein khusus untok teubit dari ER, kamoe meuteumeng bahwa pemisahan nyang bergantung bak seramida C26 hana bergantung bak interaksi protein diferensial nyang jeuet menyebabkan spesialisasi ERES (Gambar S4 ngon S5). Sebalek jih, temuan kamoe mendukong mekanisme klasifikasi alternatif nyang digerakkan uleh pengelompokan protein berbasis lipid ngon pengecualian kargo laen selanjut jih. Pengamatan kamoe menunjukkan bahwa wilayah atawa gugus Gas1-GFP nyang berhubungan ngon ERES tertentu hana protein nyang disekresikan transmembran Mid2-iRFP, nyang menunjukkan bahwa gugus GPI-AP nyang bergantung bak seramida C26 akan memfasilitasi masuknya awaknyan u dalam ERES nyang bersangkutan, dan bak watee nyang sama, mengecualikan sekretasi transmembran dan Gambar ES1 tertentu nyoe. 2). Sebalik jih, na seramida C18-C16 lam membran ER hana menyebabkan GPI-AP membentuk daerah atawa gugusan, sehingga hana mengecualikan atawa menggantikan protein yang disekresikan transmembran ke dalam ERES yang sama (Gambar 3 dan 4). . Oleh kareuna nyan, kamoe mengusulkan bahwa seramida C26 mendorong pemisahan ngon klasifikasi deungon memfasilitasi pengelompokan protein nyang terkait ngon ERES terteunte.
Kiban cara untuk meucapai clustering C26 nyang bergantung bak seramida nyoe jeut keu wilayah ER tertentu? Kecenderungan keramida membran untok meupisah seucara lateral jeuet menyebabkan keramida GPI-AP ngon C26 membentok lipid nyang ubeut ngon teurutan seucara instan lam lingkungan lipid nyang leubeh hana meuato bak membran ER nyang mengandong gliserolipid nyang leubeh paneuk ngon hana jenuh. Rumpun-rumpun nyang meukualiti (17, 18). Gugus-gugus sementara nyang ubeut nyoe jeut leubeh lanjot menyatu jeut keu gugus-gugus nyang leubeh rayeuk dan leubeh stabil lheuh meuikat bak kompleks p24 (34). Konsisten ngon nyoe, kamoe menunjukkan bahwa C26 Gas1-GFP perle berinteraksi ngon kompleks p24 untuk membentuk gugusan nyang leubeh rayeuk nyang deuh (Gambar 3). Kompleks p24 nakeuh oligomer heterozigot nyang terdiri dari peut protein transmembran p24 nyang berbida lam ragi (35), nyang menyediakan ikatan multivalen, nyang jeuet menyebabkan penghubungan silang gugusan GPI-AP ubeut, sampoe menghasekan gugusan stabil nyang leubeh rayeuk. Interaksi antara ektodomain protein GPI-AP pih jeut berkontribusi bak agregasi jih, lagee nyang dipeudeuh selama transportasi Golgi jih lam sel epitel terpolarisasi mamalia. Namun, watee seramida C18-C16 na lam membran ER, watee kompleks p24 meuikat bak Gas1-GFP, gugus-gugus rayeuk nyang teupisah hana akan terbentuk. Mekanisme nyang mendasari jih mungken bergantung bak sifeut fisik ngon kimia spesifik seramida rante asil nyang panyang. Studi biofisika membran buatan menunjukkan bahwa meskipun keramida rante asil panyang (C24) ngon paneuk (C18-C16) jeut menyebabkan pemisahan fase, hanya keramida rante asil panyang (C24) nyang jeut mempromosikan Lengkungan tinggi ngon lenturan pilem untuk membentuk ulang pilem. Meulalui saleng rujukan (17, 37, 38). Kaleuh geutunyok bahwa heliks transmembran TMED2, homolog manusia Emp24, secara selektif berinteraksi ngon sfingomielin berbasis keramida C18 lam lobus sitoplasma (39). Deungon geupake simulasi dinamika molekuler (MD), kamoe meuteumee bahwa seramida C18 ngon C26 meutumpok di sekitar lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, ngon awak nyan na preferensi nyang saban (Gambar S6). Perlu diperhatikan bahwa hal nyoe menunjukkan bahwa heliks transmembran Emp24 jeut menyebabkan distribusi asimetris lipid lam membran. Nyoe adalah hasee baroe berdasarkan sel mamalia. Simulasi MD nyang saban cit geupeuleumah na lipid eter (40) . Kareuna nyan, kamoe meuspekulasi bahwa C26 ceramide lam dua boh lobus ER26 nyan dipeukaya secara lokal. Bak watee GPI-AP bak lobus luminal langsong meuikat bak p24 multivalen ngon akumulasi keramida C26 di sekitar p24 bak lobus sitoplasma, nyan jeut mempromosikan agregasi protein nyang menyertai ngon kelengkungan membran nyang dihasekan melalui aneuk jaroe (41), menyebabkan GPI-AP cit memisahkan daerah adsen nyang tinggi. wilayah-wilayah membran ER (42). Laporan-laporan nyang ka leupah geudukong mekanisme nyang geuusulkan (43, 44). Ikatan multivalen oligolektin, patogen atawa antibodi terhadap glikosfingolipid berbasis keramida (GSL) bak membran plasma memicu agregasi GSL nyang rayeuk, meningkatkan pemisahan fase ngon menyebabkan deformasi ngon internalisasi membran (44). Iwabuchi dan laen-laen (43) Diteumee bahwa deungon na rantai asil nyang panyang (C24) teutapi hana paneuk (C16), ligan multivalen nyang meuikat bak laktosilseramida GSL menginduksi pembentukan gugusan rayeuk ngon invaginasi membran, ngon transduksi sinyal nyang dimediasi uleh sitoplasma Lyn uleh chagitropyl chagitrople nakeuh interduksi sinyal.
Bak sel epitel mamalia nyang terpolarisasi, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) sampoe tingkat membran plasma apikal geu kontrol pemisahan ngon penyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi nyoe ditulak uleh oligomerisasi GPI-AP (36), teutapi mungken cit bergantung bak panyang rante keramida nyang tanyoe teume lam ragi. Meskipun GPI-AP mamalia na jangkar berbasis lipid eter, ngon struktur kimia jih that beda ngon keramida rante asil nyang that panyang, saboh penelitian baroe-baroe nyoe meuteumee bahwa kedua lipid nyan na sifeut ngon fungsi fisik ngon kimia nyang saban seucara evolusioner (40). Oleh kareuna nyan, bagian lipid eter lam sel mamalia mungken saban ngon seramida C26 lam ragi, ngon peran jih nakeuh berhubungan ngon seramida rante panyang lam membran untok mempromosikan agregasi ngon penyortiran GPI-AP. Meskipun kemungkenan nyoe mantong perle diuji seucara langsong, temuan seugolom jih mendukong bahawa transportasi keramida rante asil nyang panyang keu tuboh Golgi hana dipeuget uleh protein transfer sitoplasma, teutapi bergantung bak sintesis jangkar GPI lagee ragi. Oleh karena nyan, mekanisme konservatif evolusioner deuh jih jeut secara selektif geu-angkut seramida rante asil nyang that panyang ngon GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) lam vesikel pengangkutan nyang saban.
Bak sistem sel epitel nyang terpolarisasi ragi ngon mamalia, agregasi ngon pemisahan GPI-AP bak protein membran plasma laen jih mandum nyan terjadi segolom troh bak permukaan sel. Paladino dkk. (48) geuteume bahwa bak TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, pengelompokan GPI-AP hana mantong perle keu klasifikasi selektif GPI-AP keu membran plasma apikal, tapi cit geuatoe organisasi pengelompokan GPI-AP ngon aktivitas biologis jih. Permukaan sel. Lam ragi, penelitian nyoe menunjukkan bahwa gugus GPI-AP nyang bergantung bak seramida C26 bak ER jeut mengatur organisasi gugus ngon aktivitas fungsional GPI-AP bak membran plasma (24, 49). Konsisten ngon model nyoe, sel GhLag1 alergi terhadap inhibitor GPI atawa ubat-ubat nyang mempengaruhi integritas dinding sel (28), ngon kebutuhan terhadap gugus Gas1-GFP fungsional (49) dari keramida ujong nyang diproyeksikan lam perkawinan sel ragi menunjukkan G Kemungkinan konsekuensi fisiologis sel hLag1. Kesalahan GPI-AP. Namun, pengujian leubeh lanjot peu organisasi fungsional permukaan sel kaleuh diprogram dari ER deungon metode penyortiran berdasarkan panyang lipid akan jeut keu subjek penelitian tanyoe ukeu.
Strain Saccharomyces cerevisiae yang geu pakek lam karya nyoe geu cantumkan lam tabel S1. Strain MMY1583 ngon MMY1635 dari SCLIM keu pencitraan sel udep ji bangun ngen latar likot W303. Strain nyoe nyang ji ekpresikan Sec13-mCherry ngen tag protein fluoresen ji bangun ngen ji pakek metode berbasis reaksi berantai polimerase (PCR) ngen plasmid pFA6a sebagai cetakan (23). Strain nyang ji ekpresikan Mid2-iRFP nyang ji bri label ngen protein fluoresen diyub kontrol promotor GAL1 ji bangun lagee berikut. Amplifikasi PCR dari urutan iRFP-KanMx dari vektor pKTiRFP-KAN (hadiah dari E. O'Shea, nomor plasmid Addgene 64687; 64687; pengidentifikasi sumber daya penelitian (RRID): Addgene_64687 yang dipeugah jeut keu endogen Kaleuh urutan genom Mid2-iRFP ji peuget ngon ji kloning u dalam promotor GAL1, ji integrasi u dalam situs Not I-Sac I dari plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 nyang ji haselkan ji linierkan ngen Pst I keu ji integrasi lam lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP geu ekpresikan di yup kontrol promotor GAL1 lam plasmid sentromer (CEN), nyang geu bangun lagee berikut. Urutan Gas1-GFP ji peuget ngen PCR dari plasmid pRS416-GFP (hadiah dari L. Popolo) dan ji kloning u dalam situs Xma I-Xho I dari plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah dari C). Peunajoh; Plasmid tambahan nyang na 51225; 51225; RRID: Tambahan_51225). Plasmid nyang ji haselkan ji boh nan pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP pih ji ekpresikan diyub kontrol promotor GAL1 dari vektor LEU2 pBEVY-GL, ngon konstruksi jih lagee berikut. Urutan Axl2-GFP ji peuget dari plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ngen PCR, dan ji kloning u dalam situs Bam HI-Pst I dari vektor LEU2 pBEVY-GL. Plasmid nyang ji haselkan ji boh nan pRGS12. Urutan oligonukleotida nyang dipakek lam penelitian nyoe geucantumkan lam Tabel S2.
Strain nyan geutamah ngon 0,2% adenin ngon 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] ekstrak ragi kaya protein p (YP) media (1 % Ekstrak ragi ngon 2% protein ept). (YPR)] atawa 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] seubagoe sumber karbon, atawa lam media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi ngon 0,5% amonium sulfat) keu peuleungkap asam amino ngon basa nyang sesuai nyang dipeureulee keu nutrisi , Dan mengandung 2% media glukosa sintetik minimal2 ( (media minimal galaktosa sintetis) seubagoe sumber karbon.
Untuk pencitraan wate nyata, sel mutan sec31-1 nyang peka suhu nyang ji ekpresikan konstruksi diyub promotor GAL1 ji tumbuh lam media YPR bak suhu 24°C si malam sampoe fase pertengahan log. Lheuh induksi lam YPG bak suhu 24°C seulama 1 jeum, sel-sel nyan geu inkubasi lam SG bak suhu 37°C seulama 30 minet, lheuh nyan geupinah u 24°C untuk geupeuleupah dari blok sekresi. Concanavalin A geupake keu geupeugot sel-sel bak geser kaca dan geucitrakan le SCLIM. SCLIM nakeuh saboh kombinasi dari mikroskop fluoresensi teubalek Olympus IX-71 ngon sistem lensa minyeuk bukaan numerik UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), rasio sinyal-keu-suara nyang meuhase ngon tinggi, pemindai spektrometer konfokal cakram meuputa (Yokogawa Electric ngon khusus), spektrometer image khusus. (Fotonik Hamamatsu) jeuet geubri sistem lensa pembesaran ngon pembesaran akhe ×266,7 ngon kamera alat nyang meugabong ngon muatan nyang geupeulipat elektron (Fotonik Hamamatsu) (21). Peusapat gamba geupeugot lé perangkat lunak khusus (Yokogawa Electric). Keu gamba 3D, kamoe meupakek aktuator piezoelektrik nyang dipeugot khusus keu meugetar lensa objektif seucara vertikal, ngon meukumpoi bagian-bagian optik nyang meujarak 100 nm lam saboh tumpukan. Gambar tumpukan Z diubah jeut keu data voxel 3D, ngen fungsi penyebaran titek teoritis yeng dipakek untuk mikroskop konfokal cakram meuputa dipakek untuk pemrosesan dekonvolusi le perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Deungon geupake perangkat lunak Volocity keu ambang otomatis keu analisis ko-lokasi, ERES termasok kargo geu uko. Analisis pemindaian gareh dipeuget deungen dipakek perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Gunakan perangkat lunak GraphPad Prism untuk neuteupeu signifikansi statistik. Untuk uji t Student dua ekor dan uji analisis varians saboh arah biasa (ANOVA), perbedaan antar kelompok dianggap na dampak nyang signifikan bak P <0,05 (*).
Untuk mikroskopi fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log dipeutumoh si malam di YPD dan dikumpoi ngen sentrifugasi, di rhah dua ge deungen saline penyangga fosfat, dan di inkubasi di ateuh eh setidak jih 15 minet, dan leuh nyan dilanjutkan di yup mikroskop lage yeng dijelaskan sigolom jih (Check24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 minyeuk PH3 CS) nyang geupeuleungkap ngon lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu ngon perangkat lunak Aplikasi Suite X (LAS X) geungui keu akuisisi. .
Sampel nyan didenaturasi ngen penyangga sampel SDS bak suhu 65°C seulama 10 minet, lheuh nyan dipisah ngen elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Untuk analisis imunoblotting, 10 μl sampel dimuat per jalur. Antibodi primer: ji pakek anti-Gas1 poliklonal kelinci bak pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci bak pengenceran 1:500, ngon anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah dari H. Riezman) bak pengenceran 1:300. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikoh ji pakek bak pengenceran 1:5000 (hadiah dari J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Imunoglobulin G (IgG) anti-kelinci kameng konjugasi peroksidase lobak (HRP) nyang geupake bak pengenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti-tikoh kameng nyang geukonjugasi ngon HRP geungui bak pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona respon imun nyan geu amati ngon metode kemiluminesens reagen Pico Barat SuperSignal (Thermo Fisher Ilmiah).
Lagee nyang dipeugah lam (31), percobaan imunopresipitasi alami dipeuget bak fraksi ER nyang dipeukaya. Singkat jih, rhah sel ragi ngon penyangga TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, campuran fenilmetilsulfonil fluorida 1 mM ngon penghambat protease) bak 600 nm ( OD600 densitik dua kali) bak 100 optik. Nyan dipeureutoh ngen manik-manik kaca, lheuh nyan putoh-putoh sel ngen manik-manik kaca dipeugadeh deungen sentrifugasi. Supernatan nyan lheuh nyan disentrifugasi bak 17.000 g seulama 15 minet bak suhu 4°C. Pelet nyan geususpensi lom lam TNE dan saponin digitalis geutamah sampoe konsentrasi akhe 1%. Suspensi nyan geu inkubasi seulama 1 jeum ngon rotasi bak suhu 4°C, lheuh nyan komponen nyang hana larut geu peugadeh ngon cara sentrifugasi bak suhu 13.000 g bak suhu 4°C seulama 60 minet. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, phon pra-inkubasi sampel ngen manik-manik agarose kosong (ChromoTek) bak suhu 4°C seulama 1 jeum, lheuh nyan inkubasi ngen GFP-Trap_A (ChromoTek) bak suhu 4°C seulama 3 jeum. Manik-manik imunopresipitasi nyan di rhah limong ge ngen TNE nyang mengandung digoksigenin 0,2%, dielusi ngen penyangga sampel SDS, dipisahkan bak SDS-PAGE, dan dianalisis ngen imunoblotting.
Lagee nyang dipeugah lam (31), penentuan cross-linking dipeuget bak fraksi ER nyang dipeukaya. Singkat jih, fraksi ER nyang dipeukaya diinkubasi ngen ditiobis 0,5 mM (suksinimidil propionat) (Pierce, Thermo Fisher Ilmiah, Rockford, IL, Amerika Serikat; 20°C, 20 mnt). Reaksi peuikat silang nyan dipeumadam deungon ditamah glisin (konsentrasi akhe 50 mM, 5 minet, 20°C).
Lagee nyang ka geujelaskan sigolom jih (50), analisis MS seramida lam strain tipe liar ngon GhLag1 geupeugot. Singkat jih, sel-sel ji peu ek sampoe fase eksponensial (3 sampoe 4 unit OD600/ml) lam YPD bak suhu 30°C, dan 25×107 sel ji panen. Metabolisme awaknyan geu peu mate ngen asam triklorasetat. Gunakan pelarut ekstraksi [etanol, ie, eter, piridin ngon amonium hidroksida 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] ngon 1,2 nmol standar internal seramida C17 (860517, lipid kutub Avanti) nyang meukualiti). Pakèk reagen monometilamin [metanol, ie, n-butanol ngon larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] keu geupeugot hidrolisis alkali ringan nibak ekstrak, lheuëh nyan pakèk n-butanol nyang jeulah ngon ië keu geupeugadeh sira. Akhé jih, ekstrak nyan geususpensi lom lam pelarut mode positif [kloroform/metanol/ie (2:7:1) + amonium asetat 5 mM] ngon geusuntik lam spektrometer massa. Pemantauan multi-reaksi (MRM) dipeuget keu identifikasi ngon kuantifikasi molekul sfingolipid. Spektrometer massa kuadrupol tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Ilmiah) dipeuleungkap deungen sumber ion aliran nano robot Nanomate HD (Biosains Advion, Ithaca, NY) untuk analisis lipid. Energi tabrakan nyan geuoptimalkan keu tiep-tiep kategori keramida. Data MS nyang dipeugot lam mode positif. Bak mandum ulangan biologis, sinyal lipid nyan adalah median dari lhee pengukuran nyang independen.
Lagee nyang dipeugah lam (31), sel-sel (800×107) nyang mengekspresikan Gas1-GFP dipeulaku imunopresipitasi alami. Gas1-GFP nyang ka geumurnikan geupisah le SDS-PAGE dan geupinah keu membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein nyan geu visualisasikan ngen geuwarnai PVDF ngen itam amida. Pita Gas1-GFP geukoh dari PVDF dan geuraseu 5 kali ngon metanol dan sigo ngon ie grade kromatografi cair-MS (LC-MS). Deungon geu inkubasi strip membran ngon 500 μl NaOAc 0,3 M (pH 4,0), penyangga ngon 500 μl campuran natrium nitrit 1 M nyang baroe geularut bak suhu 37°C seulama 3 jeum, fraksi lipid geupeuleupah dari Gas1-GFP ngon inosa inosamin nyang geulis Peuleupah dari inosamin. (51). Lheueh nyan, strip membran nyan geuraseu peuet go ngon ie grade LC-MS, geuthoe bak suhu ruangan, dan geukeubah lam atmosfer nitrogen bak suhu -80°C sampoe geuanalisis. Seubagoe kontrol, sampel kosong membran PVDF dipakek keu tiep-tiep percobaan. Lipid nyang diekstraksi dari Gas1-GFP lheuh nyan dianalisis le MS lagee nyang dipeugah (50). Singkat jih, strip PVDF nyang na GPI-lipid geususpensi lom lam pelarut cetakan negatif 75 μl [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] dan geulewati ionisasi elektrosemprot (ESI)-Analisis MRM/MS dari spesies sfingolipid (TSQ Vantage). Lam hai nyoe, data MS dipeugot lam mode ion negatif.
Lagee nyang ka geukheun dilee, bagian lipid jangkar GPI geupisah dari GPI-AP nyang geubri label [3H]-inositol (16). Lipid nyan geupisah ngon kromatografi lapisan tipih nyang geungui sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) ngon geugamba ngon geungui FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel nyang mengekspresikan Gas1-GFP (600×107) dicuci dua ge ngen penyangga TNE ngen penyangga TNE, dan dipeureutoh ngen manik-manik kaca, dan lheuh nyan disentrifugasi untuk dipeugadeh putoh-putoh sel dan manik-manik kaca. Supernatan nyan lheuh nyan disentrifugasi bak 17.000 g seulama 1 jeum bak suhu 4°C. Pelet nyan geuraseu lam TNE dan geu inkubasi ngon 1 U PI-PLC (Invitrogen) lam TNE nyang na 0,2% saponin digitalis seulama 1 jeum bak suhu 37°C. Lheueh geupeugot enzim, membran nyan geucok ngon cara sentrifugasi bak 17.000 g bak suhu 4°C seulama 1 jeum. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan ji inkubasi ngen GFP-Trap_A (KromoTek) bak suhu 4°C si malam. Gas1-GFP nyang ka geumurnikan nyang geupisah le SDS-PAGE geuwarnai ngon warna biru brilian Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP dikoh dari warna abu-abu nyang na di sekitar aqueduct, dan lheuh nyan lheuh alkilasi deungon iodoasetamida dan reduksi deungon dithiotreitol, pencernaan lam gel deungon trypsin dipeuget. Ekstrak ngon thoe peptida tryptik ngon peptida ngon GPI-glikan. Peptida nyang ka thoe nyan geularut lam 20 μl ie. Suntikkan saboh bagian (8μl) lam LC. Saboh kolom oktadesilsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter dalam 150 mm×1,0 mm; Kimia Nomura, Prefektur Aichi, Jepang) dipakek untuk meupisah peptida lam kondisi gradien terteunte. Fase mobile nakeuh pelarut A (0,08% asam formik) ngon pelarut B (0,15% asam formik lam 80% asetonitril). Sistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) dipakek untuk dieluasi kolom ngen pelarut A lam watee 55 minet bak laju aliran 50 μl min-1 seulama 5 minet, lheuh nyan konsentrasi pelarut B dipeu ek jeut keu 40%. , Amerika Serikat). Eluat nyan sabe geupeutamong u dalam sumber ion ESI, ngon peptida tryptik ngon peptida ngon GPI-glikan geuanalisis le LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa jeubak-orbitrap ion linier hibrida; Thermo Fisher Ilmiah). Lam setup MS, tegangan sumber kapiler geuset keu 4,5 kV, dan suhu kapiler transfer geujaga bak 300°C. Teugangan kapiler ngon teugangan lensa tabung geu-set keu 15 V ngon 50 V. Data MS dipeugot lam mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) lam rentang massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS dipeugot lewat jeubak ion lam XLthe dibit nyang phon that [1000]. disosiasi nyang dipeugot le tabrakan (CID)].
Simulasi MD geupeugot ngon geungui perangkat lunak GROMACS (52) ngon medan gaya MARTINI 2 (53-55). Pembangun Membran GUI CHARMM (56, 57) lheuh nyan dipakek untuk membangun lapisan ganda nyang mengandung dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) ngon Cer C18 atawa DOPC ngon Cer C26. Topologi ngen koordinat Cer C26 berasal dari DXCE deungen dipeugadeh manik-manik ekstra dari iku sphingosin. Gunakan proses nyang dipeugah di miyup nyoe untuk neuimbangi lapisan ganda dan neujalankan, lheuh nyan neupakek koordinat akhe dari sistem untuk neubangun sistem nyang na Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 sampoe 193) dibangun seubagoe heliks α nyang dipakek struktur molekul alat MD (VMD) visual (58). Kemudian, lheuh dipeugadeh lipid nyang tumpang tindeh, protein nyan dipeuget granulasi kasar dan dipeutamong lam lapisan ganda dipakek CHARMM GUI. Sistem akhé na 1202 DOPC ngon 302 Cer C26 atawa 1197 DOPC ngon 295 Cer C18 ngon Emp24. Ion sistem nyan sampoe konsentrasi 0,150M. Peut ulangan independen dipeuget keu dua komposisi lapisan ganda.
Lapisan ganda lipid nyan geuimbangi ngon geungui proses GUI CHARMM, nyang meulibatkan minimalisasi ngon lheuh nyan geuimbangi 405.000 langkah, dipat batasan posisi secara bertahap geupeukureueng ngon geupeugadeh, ngon langkah watee geupeuék dari 0,005 ps jeuet keu 0,02 ps. Lheueh keuimbangan, jipeuhasé 6 μs ngon langkah watèe 0,02 ps. Lheueh tapeutamong Emp24, tapeuguna proses GUI CHARMM nyang saban keu tapeuminimal dan tapeuseimbang sistem, lheuh nyan tapeujak seulama 8 s lam produksi.
Keu mandum sistem, lam proses penyeimbangan, teukanan geukontrol le barostat Berendsen (59), ngon lam proses produksi, teukanan geukontrol le barostat Parrinello-Rahman (60). Lam mandum hai, teukanan rata-rata nakeuh 1 bar ngon skema peugabungan teukanan semi-isotropik geungui. Lam proses keseimbangan ngon produksi, termostat (61) ngon rekalibrasi kecepatan geungui keu geupasang suhu partikel protein, lipid ngon pelarut maseng-maseng. Lam mandum operasi, suhu target nakeuh 310K. Interaksi non-ikatan dihitong deungon menghasekan daftar pasangan deungon menggunakan skema Verlet deungon toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb dihitong deungon dipakek medan reaksi ngen jarak potong 1,1 nm. Istilah Vander Waals dipakek skema potong deungen jarak potong 1,1 nm, ngen skema potong Verlet dipakek untuk potensi pergeseran (62).
Deungon geupake VMD, panyang gelombang cutoff antara manik-manik fosfat DOPC atawa manik-manik seramida AM1 ngon protein nakeuh 0,7 nm, ngon jumlah lipid nyang berinteraksi ngon protein geuhitong. Meunurot rumus di miyup nyoe, hitong faktor depletion-peungayaan (DE) lagee lam (63): Faktor DE = (jumlah total lipid lam protein 0,7) lam protein 0,7 (jumlah Cer lam total lipid) .
Nilai nyang dilaporkan dipeugot seubagoe rata-rata, dan bar kesalahan nakeuh peut boh salinan independen dari SE. Signifikansi statistik faktor DE dihitong deungon uji t [(rata-rata faktorDE-1)/SE]. Hitong nilai P dari distribusi saboh ekor.
Alat GROMACS geungui keu geuhitong peta kepadatan lateral 2D dari sistem nyang na Emp24 lam 250 ns akhe dari jeujak. Keu meuteumee peta pengayaan/peuhabéh seramida, peta kepadatan Cer geubagi ngon jumlah peta Cer ngon DOPC, lheuh nyan geubagi ngon konsentrasi Cer lam tuboh. Skala peta warna nyang saban geungui.
Keu bahan tambahan keu tulesan nyoe, neukalön bak http://advances.sciencemag.org/cgi.
Nyoë nakeuh saboh artikel akses teubuka nyang geusebarkan dimiyub syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, nyang meumungkén keu geungui, geusebarkan ngon geupeureproduksi lam media peu mantong, asai geungui akhé kon keu keuntongan komersial ngon premis jih nakeuh bahwa karya asli nyan beutôi. Rujokan.
Catatan: Kamoe hanya meulakee droeneuh neubri alamat email droeneuh supaya ureung nyang droeneuh rekomendasikan keu laman nyan jiteupeu bahwa droeneuh neumeuheut awak nyan kalon email nyan dan bahwa email nyan kon spam. Kamoe hana akan meureukam alamat email sapeu.
Soalan nyoe geungui keu geutes peuë droëneuh nakeuh ureuëng tamong ngon geucegah otomatis neukirém spam.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan wate nyata 3D resolusi tinggi geu peugah penteng jih panyang rante keramida keu penyortiran protein di situs output selektif.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan wate nyata 3D resolusi tinggi geu peugah penteng jih panyang rante keramida keu penyortiran protein di situs output selektif.
©2020 Asosiasi Amerika keu Kemajuan Sains. mandum hak geukeubah. AAAS nakeuh mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kemajuan Sains ISSN 2375-2548.