Saat nyoe *Alamat saat nyoe: Cologne 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulan Cologne tentang Respon Stres Seluler dalam Penyakit Terkait Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi peunyaket mitokondria dianggap hana jeut dipeubalek karena plastisitas metabolisme neuron terbatas, tapi efek disfungsi mitokondria bak otonomi sel metabolisme neuron bak tuboh hana jeulah dipahami. Di sinoe, kamoe meupeuturi proteom spesifik sel neuron Purkinje ngon defisiensi OXPHOS progresif nyang diseubabkan uleh dinamika fusi mitokondria nyang terganggu. Kamoe meuteumeng bahawa disfungsi mitokondria memicu perubahan mendalam lam bidang proteomik, akhe jih mengarah bak aktivasi berurutan program metabolisme nyang teupat segolom kematian sel. Hana teusangka-sangka, kamoe meuteunte induksi nyang jeulaih dari piruvat karboksilase (PCx) ngon peroksidase laen nyang meukaet ngon peuleungkap perantara siklus TCA. Inhibisi PCx geupeuparah stres oksidatif ngon neurodegenerasi, nyan menunjukkan bahwa aterosklerosis na efek peulindong bak neuron nyang hana OXPHOS. Restorasi fusi mitokondria bak neuron nyang degenerasi secara terminal sepenuh jih membalikkan karakteristik metabolisme nyoe, sampoe mencegah kematian sel. Temuan kamoe mengidentifikasi jalur nyang segolom jih hana dituri nyang geubri ketahanan terhadap disfungsi mitokondria ngon menunjukkan bahwa neurodegenerasi jeut terbalik bahkan bak tahap akhe peunyaket.
Peran sentral mitokondria lam mempertahankan metabolisme energi neuronal ditekankan oleh gejala neurologis nyang ekstensif nyang berhubungan ngon peunyaket mitokondria manusia. Sebagian besar penyakit nyoe disebabkan oleh mutasi gen yang mengatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) atau destruksi gen yang berhubungan dengan dinamika mitokondria, yang secara hana langsong mempengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Pekerjaan bak model binatang kaleuh menunjukkan bahwa sebagai respon terhadap disfungsi mitokondria bak jaringan sekitar jih, jalur metabolisme konservatif (5-7) jeut diaktifkan, sehingga geubri wawasan peunteng teuntang patogenesis peunyaket kompleks nyoe. Sebalik jih, pemahaman geutanyoe teuntang perubahan metabolisme dari jenis sel terteunte nyang diseubabkan oleh kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak adalah mendasar (8), menekankan kebutuhan untuk mengidentifikasi target terapeutik nyang jeut dipakek untuk mencegah atawa mencegah peunyaket. Meucegah keunong peunyakét saraf (9). Kureung jih informasi nakeuh fakta bahwa sel saraf secara luah geuanggap na fleksibilitas metabolisme nyang that terbatas dibandengkan ngon jenis sel jaringan sekitar jih (10). Meunyoe ta ingat bahwa sel-sel nyoe berperan sentral lam mengkoordinasikan pasokan metabolit keu neuron untuk mempromosikan transmisi sinaptik ngon menanggapi kondisi luka ngon peunyaket, kemampuan untuk menyesuaikan metabolisme sel ngon kondisi tantangan jaringan otak karap terbatas bak sel glial (11-14). Selaen nyan,heterogenitas seluler nyang meulekat bak jaringan otak sebagian rayeuk menghambat studi perubahan metabolisme nyang terjadi bak subkelompok neuronal terteunte. Akibat jih, bacut nyang dituri tentang konsekuensi seluler ngon metabolisme nyang teupat dari disfungsi mitokondria bak neuron.
Untuk meuphom konsekuensi metabolisme dari disfungsi mitokondria, kamoe meuisolasi neuron Purkinje (PN) lam tahap neurodegenerasi nyang berbeda nyang disebabkan oleh kehancuran fusi membran lua mitokondria (Mfn2). Meskipun mutasi Mfn2 bak manusia na hubungan ngen bentuk neuropati sensorik motorik keturunan nyang dikeunai sebagei Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), peuhancoe bersyarat Mfn2 bak tikoh adalah induksi disfungsi fosforilasi oksidasi (OXthoPHOS) nyang diakui ngen get. Berbagai subtipe neuron (16-19) dan fenotipe neurodegeneratif yang dihasilkan disertai dengan gejala neurologis yang progresif, lage gangguan gerak (18, 19) atau ataksia otak kecil (16). Deungon geupake kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, ngon metode virologis, kamoe menunjukkan bahwa neurodegenerasi progresif that menginduksi piruvat karboksilase (PCx) ngon faktor laen nyang terlibat lam arteriosklerosis PN lam vivo Ekspresi enzim. Untuk memverifikasi relevansi temuan nyoe, kamoe secara khusus mengatur ekspresi PCx lam PN defisiensi Mfn2, ngon meuteume bahwa operasi nyoe memperburuk stres oksidatif ngon mempercepat neurodegenerasi, sehingga membuktikan bahwa azoospermia geubri kematian sel kemampuan adaptasi metabolisme. Ekspresi nyang parah dari MFN2 jeut sepenuh jih menyelamatkan degenerasi terminal PN ngon defisiensi OXPHOS nyang parah, konsumsi DNA mitokondria nyang rayeuk, ngon jaringan mitokondria nyang deuh jih putoh, nyang leubeh lanjot menekankan bahwa bentuk neurodegenerasi nyoe bahkan jeut puleh bak tahap lanjut peunyaket sel.
Untuk geu visualisasikan mitokondria lam PN knockout Mfn2, kamoe geu pakek strain tikoh nyang memungkenkan mitokondria nyang bergantung bak Cre untuk geu targetkan protein fluoresen kuneng (YFP) (mtYFP) (20) Ekspresi Cre ngon geu periksa morfologi mitokondria lam vivo. Kamoe meuteumee bahwa peuhancoe gen Mfn2 lam PNs akan menyebabkan pembagian bertahap jaringan mitokondria (Gambar S1A), ngon perubahan paleng awai meuteumee bak umu 3 minggu. Sebalik jih, degenerasi substansial lapisan sel PN, lagee nyang dibuktikan ngon gadoh imunostaining Calbindin, hana dimulai sampoe umu 12 minggu (Gambar 1, A ngon B). Keu hana cocokan watee antara perubahan paleng awai lam morfologi mitokondria ngon mulai kematian neuron nyang deuh mendorong geutanyoe untuk menyelidiki perubahan metabolisme nyang dipicu oleh disfungsi mitokondria segolom kematian sel. Kamoe meukembangkan strategi berbasis penyortiran sel nyang diaktifkan fluoresensi (FACS) untuk meuisolasi PN nyang mengekspresikan YFP (YFP +) (Gambar 1C), dan bak tikoh kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), selanjut jih disebut CT1BRL (Gambar). Optimalisasi strategi gerbang berdasarkan intensitas relatif sinyal YFP memungkenkan geutanyoe untuk tapeumurni tuboh YFP + (YFPhigh) dari PN dari non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atawa fragmen akson / dendritik fluoresen nyang diduga (YFPlow; Gambar S1D, konfopekal, wi). Untuk verifikasi identitas populasi nyang diklasifikasikan, kamoe meulakukan proteomik LFQ dan lheuh nyan analisis komponen utama, dan meuteumee bahwa na pemisahan nyang jeulaih antara sel YFPhigh ngon YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh menunjukkan pengayaan gleh dari penanda PNs yang diketahui (yaitu Calb1, Pcp2, Grid2 dan Itpr3) (21, 22), tapi hana pengayaan protein yang umum diekspresikan dalam neuron atau jenis sel laen (Gambar 1D) ). Perbandingan antara sampel lam sel YFPhigh nyang diklasifikasikan nyang dikumpoi lam eksperimen independen geupeuleumah koefisien korelasi> 0,9, geupeuleumah reproduksi nyang jroh antara ulangan biologis (Gambar S1E). Singkat jih, data nyoe geuvalidasi rencana kamoe untuk isolasi akut dan spesifik dari PN nyang layak. Kareuna sistem penggerak L7-cre nyang dipakek menginduksi rekombinasi mosaik bak minggu phon lheuh melahirkan (23), kamoe mulai membunuh tikoh dari CTRL dan bersyarat (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kumpulkan neuron. Lheueh rekombinasi ka seuleusoe, geukheun Mfn2cKO bak umu 4 minggu. Seubagoe titik akhe, kamoe memilih umu 8 minggu watee lapisan PN mantong utoh meskipun fragmen mitokondria nyang jeulaih (Gambar 1B dan Gambar S1A). Secara total, kamoe meukira total 3013 protein, dimana sekitar 22% berdasarkan anotasi MitoCarta 2.0 berdasarkan proteom mitokondria seubagoe mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial nyang dipeuget bak minggu 8 menunjukkan bahwa hanya 10,5% dari mandum protein nyang na perubahan nyang signifikan (Gambar 1F ngon Gambar S1F), di pat 195 protein nyang diatur u miyueb ngon 120 protein nyang diatur u ateuh (Gambar 1F). Perlu diperhatikan bahwa "analisis jalur inovatif" dari himpunan data nyoe menunjukkan bahwa gen yang diekspresikan secara berbeda terutama termasuk ke dalam himpunan jalur metabolisme spesifik yang terbatas (Gambar 1G). Nyang menarek jih, meuseuki regulasi jalur nyang berhubongan deungon OXPHOS ngon pensinyalan kalsium mengkonfirmasi induksi disfungsi mitokondria lam PN defisiensi fusi, kategori laen nyang terutama melibatkan metabolisme asam amino secara signifikan diatur, nyang sejalan deungon metabolisme mitochdrial P nyang terjadi. Peukabel ulang nyan konsisten. hana fungsi.
(A) Foto konfokal perwakilan bagian otak tikus CTRL dan Mfn2cKO nyang menunjukkan gadoh PNs progresif (calbindin, abu-abu); inti geulawan ngon DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians saboh arah, ***P<0,001; n = 4 sampoe 6 bulatan dari lhee boh tikoh). (C) Alur buet nyang geu-eksperimen. (D) Distribusi peta suum penanda khusus keu Purkinje (ateuh) ngon jenis sel laen (teungoh). (E) Diagram Venn nyang geupeuleumah jumlah protein mitokondria nyang geuidentifikasi lam PN nyang geuklasifikasikan. (F) Plot gunong meuapui protein nyang diekspresikan secara berbeda bak neuron Mfn2cKO bak 8 minggu (nilai potong signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas menunjukkan limong jalur regulasi ateuh (mirah) dan regulasi miyueb (biru) nyang paleng peunteng lam PN Mfn2cKO nyang diklasifikasikan seubagoe 8 minggu. Tingkat ekspresi rata-rata dari tiep protein nyang ji deteksi ji peutunyok. Peta suum skala abu-abu: nilai P nyang disesuaikan. ns, hana peunteng.
Data proteomik menunjukkan bahwa ekspresi protein kompleks I, III, ngon IV secara bertahap menuron. Kompleks I, III, ngon IV mandum na subunit nyang dikodekan mtDNA esensial, seudangkan kompleks II, nyang hanya dikodekan nuklir, bak dasar jih hana terpengaroh (Gambar 2A ngon Gambar S2A). . Konsisten ngon hasee proteomik, imunohistokimia bagian jaringan otak kecil geupeuleumah bahwa tingkat subunit MTCO1 (subunit sitokrom C oksidase mitokondria 1) kompleks IV lam PN secara bertahap menurun (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 nyang dikodekan mtDNA secara signifikan menuron (Gambar S2A), seudangkan tingkat keadaan stabil subunit sintase ATP nyang dikodekan nuklir teutap hana berubah, nyang konsisten ngon kompleks F1 subassembly sintase ATP nyang stabil nyang dituri watee ekspresi mtDNA stabil. Pembentukan jih konsisten. Peugadoh (7). Evaluasi tingkat mtDNA lam PN Mfn2cKO nyang diurutkan le reaksi berantai polimerase watee nyata (qPCR) geukonfirmasi penurunan jumlah salinan mtDNA secara bertahap. Dibandingkan ngon kelompok kontrol, bak umu 8 minggu, hanya sekitar 20% dari kadar mtDNA Was dipeutheun (Gambar 2C). Konsisten ngon hasee nyoe, pewarnaan mikroskop konfokal Mfn2cKO PNs keu mendeteksi DNA menunjukkan konsumsi nukleotida mitokondria nyang bergantung bak watee (Gambar 2D). Kamoe meuteumeng bahawa hanya meupadum kandidat nyang teulibat lam degradasi protein mitokondria ngon respon stres nyang diatur, teumasok Lonp1, Afg3l2 ngon Clpx, ngon faktor perakitan kompleks OXPHOS. Hana perubahan signifikan bak tingkat protein nyang terlibat lam apoptosis nyang dideteksi (Gambar S2B). Meunan cit, kamoe meuteumee bahwa mitokondria ngon saluran retikulum endoplasma nyang terlibat lam transportasi kalsium hanya na perubahan ubeut (Gambar S2C). Seulaen nyan, evaluasi protein nyang terkait autofagi hana meuteumeung perubahan nyang signifikan, nyang konsisten ngon induksi autofagosom nyang deuh nyang diamati lam vivo le imunohistokimia ngon mikroskopi elektron (Gambar S3). Namun, disfungsi OXPHOS nyang progresif bak PNs disertai ngon perubahan mitokondria ultrastruktur nyang jeulah. Gugus mitokondria jeut takalon bak tuboh sel ngon bak dendritik PN Mfn2cKO nyang umu 5 ngon 8 minggu, ngon struktur membran dalam ka mengalami perubahan mendalam (Gambar S4, A ngon B). Konsisten ngon perubahan ultrastruktur nyoe ngon penurunan mtDNA nyang signifikan, analisis irisan otak otak akut ngon ester metil tetrametilrodamin (TMRM) menunjukkan bahwa potensi membran mitokondria lam PN Mfn2cKO signifikan menurun (Gambar S4C).
(A) Analisis perjalanan watee tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Hanya mempertimbangkan protein deungon P<0,05 bak 8 minggu (ANOVA dua arah). Gareh puteh-puteh: Hana penyesuaian meunyo tabandeng ngon CTRL. (B) Wi: Contoh bagian otak kecil nyang geubri label ngon antibodi anti-MTCO1 (skala bar, 20 μm). Wilayah nyang geuduëk lé tuboh sel Purkinje geutôp lé warna kunèng. Uneun: Kuantifikasi kadar MTCO1 (analisis varians saboh arah; n = 7 sampoe 20 sel nyang dianalisis dari lhee boh tikoh). (C) Analisis qPCR jumlah salinan mtDNA lam PN nyang diurutkan (analisis varians saboh arah; n = 3 sampoe 7 tikoh). (D) Wi: Contoh saboh slice otak kecil nyang geubri label ngon antibodi anti-DNA (skala bar, 20 μm). Wilayah nyang geuduëk lé tuboh sel Purkinje geutôp lé warna kunèng. Unen: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians saboh arah; n = 5 sampoe 9 sel dari lhee boh tikoh). (E) Contoh bagian otak akut nyang geupeuleumah sel mitoYFP + Purkinje (panah) lam rekaman penjepit patch seluruh sel. (F) Kuantifikasi kurva IV. (G) Rekaman perwakilan injeksi arus depolarisasi lam sel Purkinje CTRL ngon Mfn2cKO. Top trace: Pulsa phon nyang memicu AP. Jeujak miyueb: Frekuensi AP maksimum. (H) Kuantifikasi input spontan pascasinaptik (sPSP). Jeujak rekaman perwakilan ngon rasio zoom jih geupeuleumah bak (I). Analisis varians saboh arah geu analisa n = 5 sampoe 20 sel dari lhee boh tikoh. Data dinyatakan seubagoe rata-rata±SEM; *P<0,05; **P<0,01 keu; ***P<0,001 nyan. (J) Jeujak perwakilan AP spontan nyang dicatat deungon menggunakan mode klem patch berlubang. Jeujak ateuh: Frekuensi AP maksimum. Jeujak miyueb: zoom saboh AP. (K) Takira frekuensi AP rata-rata ngon maksimum meunurot (J). Tes Mann-Witney; n = 5 sel nyang geuanalisis dari peut boh tikoh. Data dinyatakan seubagoe rata-rata±SEM; hana peunténg.
Kerusakan OXPHOS nyang jeulaih jiteumee bak PN Mfn2cKO nyang umue 8 minggu, nyan menunjukkan bahwa fungsi fisiologis neuron brat that abnormal. Kareuna nyan, kamoe meuanalisis karakteristik listrek pasif neuron defisiensi OXPHOS bak 4 sampoe 5 minggu dan 7 sampoe 8 minggu deungon cara peugot rekaman klem patch seluruh sel lam irisan cerebellar akut (Gambar 2E). Hana terduga, rata-rata potensi membran istirahat ngon resistensi input neuron Mfn2cKO saban ngon kontrol, meskipun na perbedaan halus antara sel (Tabel 1). Meunan cit bak umu 4 sampoe 5 minggu, hana diteumee perubahan signifikan lam hubungan arus-tegangan (kurva IV) (Gambar 2F). Namun, hana neuron Mfn2cKO nyang umu jih 7 sampoe 8 minggu nyang bertahan dari rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), nyan menunjukkan bahwa na sensitivitas nyang jeulah terhadap potensi hiperpolarisasi bak tahap akhe nyoe. Sebalik jih, bak neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi nyang menyebabkan debit potensial aksi berulang (AP) ditoleransi deungon get, menunjukkan bahwa pola debit awaknyan secara keseluruhan hana signifikan berbeda ngon neuron kontrol nyang umue 8 minggu (Tabel 1 ngon Gambar 2G). Meunan cit, frekuensi ngon amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) sebandeng ngon kelompok kontrol, ngon frekuensi kejadian meutamah dari 4 minggu jeut keu 5 minggu jeut keu 7 minggu jeut keu 8 minggu ngon peningkatan nyang saban (Gambar 2, H ngon I). Masa pematangan sinaptik bak PN (25). Hase nyang saban dipeugot lheuh patch PNs nyang berlubang. Konfigurasi nyoe mencegah kemungkenan kompensasi cacat ATP seluler, lagee nyang mungken terjadi lam rekaman penjepit patch seluruh sel. Secara khusus, potensi membran istirahat ngon frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO hana terpengaroh (Gambar 2, J ngon K). Singkat jih, hasee nyoe menunjukkan bahwa PN deungon disfungsi OXPHOS nyang jeulaih jeut geuhadapi pola debit frekuensi tinggi deungon get, menunjukkan bahwa na mekanisme kompensasi nyang memungkenkan awaknyan untuk geupeutheun respon elektrofisiologis nyang karap normal.
Data dinyatakan seubagoe rata-rata ± SEM (analisis varians saboh arah, tes perbandingan berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor satuan geutunyok ngon tanda kurung.
Kamoe meujak keu meunyelidiki peu kategori peu mantong lam dataset proteomik (Gambar 1G) mencakup jalur nyang jeut meulawan defisiensi OXPHOS nyang parah, deungon lagee nyan menjelaskan pakon PN nyang terkena jeut mempertahankan elektrofisiologi nyang karap normal (Gambar 2, E sampoe K). . Analisis proteomik menunjokkan bahawa enzim nyang teulibat lam katabolisme asam amino rante bercabang (BCAA) secara signifikan diatur (Gambar 3A ngon Gambar S5A), ngon produk akhe asetil-CoA (CoA) atawa suksinil CoA jeuet meuleungkapi trikarboksilat lam arteriosklerosis. Kamoe meuteumee bahwa kandungan transaminase BCAA 1 (BCAT1) ngon BCAT2 bandua meutamah. Awak nyan mengkatalisis langkah phon katabolisme BCAA deungon menghasekan glutamat dari α-ketoglutarat. Mandum subunit nyang membentuk kompleks keto asam dehidrogenase (BCKD) rante bercabang diatur (kompleks nyan mengkatalisis dekarboksilasi selanjut jih ngon hana jeuet dipeubalek dari rangka karbon BCAA nyang dihasekan) (Gambar 3A ngon Gambar S5A). Namun, hana perubahan nyang jeulaih bak BCAA nyan keudroe nyang diteumee lam PN nyang diurutkan, nyang mungken diseubabkan le peningkatan pengambilan seluler asam amino esensial nyoe atawa penggunaan sumber laen (glukosa atawa asam laktat) untuk meuleungkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN nyang hana OXPHOS cit menunjukkan peningkatan dekomposisi ngon aktivitas transaminasi glutamin bak umu 8 minggu, nyang jeut dicerminkan le up-regulasi enzim mitokondria glutaminase (GLS) ngon glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A ngon C). Perlu diperhatikan bahwa regulasi GLS terbatas bak isoform glutaminase C (GLS-GAC) nyang disambung (perubahan Mfn2cKO/CTRL kira-kira 4,5 kali lipat, P = 0,05), ngon regulasi spesifik jih lam jaringan bionergiondria Jeut mendukung mitokondria. (27).
(A) Peta haba menunjukkan perubahan lipatan tingkat protein untuk rute yang ditentukan bak 8 minggu. (B) Contoh saboh slice otak kecil nyang geubri label ngon antibodi anti-PCx (skala bar, 20 μm). Panah kuneng nyan jitunyok bak tuboh sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein perjalanan watee nyang diidentifikasi seubagoe calon peunteng keu aterosklerosis (uji t berganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikoh). (D) Di ateuh: Diagram skematis nyang geupeuleumah cara-cara nyang meubeda keu tamong lam karbon nyang ka geubri label nyang na lam [1-13C]piruvat tracer (yaitu, melalui PDH atawa rute trans-arteri). Miyueb: Bagan biola geupeuleumah persentase karbon nyang na label tunggal (M1) nyang geuubah jeut keu asam aspartat, asam sitrat ngon asam malat lheuh geubri label keu irisan otak akut ngon [1-13C]piruvat (tes t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis seujarah watee nyang komprehensif nibak jalan nyang geutunyok. Hanya geupertimbangkan protein ngen P<0,05 bak 8 minggu. Gareh putus-putus: hana nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data dinyatakan seubagoe rata-rata±SEM.
Lam analisis kamoe, katabolisme BCAA kaleuh jeuet keu salah saboh jalur regulasi utama. Fakta nyoe that menunjukkan bahwa volume ventilasi nyang tamong lam siklus TCA mungken berubah bak PN nyang hana OXPHOS. Nyoe mungken mewakili bentuk utama dari kabel ulang metabolisme neuronal, nyang mungken na dampak langsong bak fisiologi neuronal ngon kelangsungan udep selama pemeliharaan disfungsi OXPHOS nyang parah. Konsisten ngon hipotesis nyoe, kamoe meuteumee bahwa enzim anti-aterosklerotik utama PCx nyan diatur ateuh (Mfn2cKO/CTRL berubah kira-kira 1,5 kali; Gambar 3A), nyang mengkatalisis konversi piruvat jeut keu oksaloasetat (28), nyang dipeucaya na lam brain, nyang dipeucaya na lam brat2. 30). Konsisten ngon hase proteomik, mikroskopi konfokal menunjukkan bahwa ekspresi PCx secara spesifik ngon signifikan meningkat bak PN defisiensi OXPHOS, sedangkan reaktivitas PCx terutama terbatas bak sel glial Bergmann nyang toe ngon kontrol (Gambar 3B). Untuk geutes secara fungsional upregulasi PCx nyang diamati, kamoe meurawat irisan otak akut ngon [1-13C] pelacak piruvat. Bak watee piruvat dioksidasi uleh piruvat dehidrogenase (PDH), label isotop jih gadeh, teutapi dipeutamong lam perantara siklus TCA watee piruvat dimetabolisme uleh reaksi vaskular (Gambar 3D). Untuk mendukung data proteomik kamoe, kamoe meuamati sejumlah rayeuk penanda dari pelacak nyoe lam asam aspartat dari irisan Mfn2cKO, sedangkan asam sitrat dan asam malat pih na tren moderat, meskipun hana signifikan (Gambar 3D).
Bak neuron dopamin tikoh MitoPark ngon disfungsi mitokondria nyang diseubabkan oleh neuron dopamin nyang secara khusus meuhancokan gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx cit secara signifikan diatur (31), menunjukkan bahwa disfungsi neuroseton disekurenserosis. OXPHOS lam tuboh. Perlu diperhatikan bahwa kaleuh diteumee bahwa enzim unik (32-34) nyang mungken diekspresikan bak neuron nyang mungken berhubungan ngon arteriosklerosis secara signifikan diatur bak PN nyang hana OXPHOS, lagee propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonil-CoA mitochilCoA meubah jeut keu enzim 3 (ME3), nyang peran utama jih nakeuh keu geupeupuléh piruvat nibak malat (Gambar 3, A ngon C) (33, 35). Seulaen nyan, kamoe meuteumee peningkatan signifikan bak enzim Pdk3, nyang fosforilasi dan deungon lagee nyan inaktifkan PDH (36), sedangkan hana perubahan nyang dideteksi bak enzim Pdp1 nyang mengaktifkan PDH atawa kompleks enzim PDH nyan keudroe (Gambar 3A). Secara konsisten, lam PNs Mern2cKO, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) dari komponen piruvat dehidrogenase E1 dari kompleks PDH lam Ser293 (dituri menghambat aktivitas enzim PDH) ditingkatkan ( Gambar S6C ) (Gambar S6). Piruvat hana akses pembuluh darah.
Akhe jih, kamoe meuteumee bahwa jalur super biosintesis serin ngon glisin, siklus mitokondria folat (1C) nyang terkait ngon biosintesis prolin (Gambar 1G ngon Gambar S5C) mandum secara signifikan up-regulated, meunurot laporan, seulama proses aktivasi. Jaringan-jaringan nyang na di sekitar jih geuaktivasi ngon disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal nyang mendukung data proteomik nyoe menunjukkan bahwa bak PN ngen OXPHOS nyang gadeh, irisan otak kecil tikoh nyang umue 8 minggu dipeulaku serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci dari siklus folat mitokondria. Respon imun nyang signifikan (Gambar S5D). Lam 13 irisan otak akut nyang diinkubasi glukosa CU, eksperimen pelacakan metabolisme leubeh lanjot mengkonfirmasi regulasi biosintesis serin ngon prolin, nyang menunjukkan bahwa fluks isoform karbon jeut keu serin ngon prolin meningkat (Gambar S5E). Kareuna reaksi nyang dipromosikan uleh GLS ngon GPT2 bertanggung jaweub ateuh sintesis glutamat dari glutamin ngon transaminasi antara glutamat ngon α-ketoglutarat, upregulasi jih menunjukkan bahwa neuron nyang defisiensi OXPHOS na peningkatan permintaan glutamat. Berbeda ngon perubahan nyoe, analisis proteomik astrosit serebelum dari tikoh Mfn2cKO spesifik PN menunjukkan bahwa jalur nyoe (termasuk mandum antiperoksidase) hana berubah secara signifikan lam ekspresi, sehingga menunjukkan pengalihan metabolisme nyoe selektif keu PN nyang terdegradasi (Gambar S6, G6).
Singkat jih, analisis nyoe meungkap pola aktivasi temporal jalur metabolisme spesifik lam PN nyang signifikan berbeda. Meskipun fungsi mitokondria neuronal abnormal jeut menyebabkan aterosklerosis awai ngon remodeling 1C (Gambar 3E ngon Gambar S5C), ngon bahkan perubahan nyang jeut diprediksi lam ekspresi kompleks I ngon IV, perubahan sintesis serin de novo hanya hanya jeut keu jeulah bak tahap akhe. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E dan Gambar S5C). Temuan nyoe mendefinisikan proses berurutan dipat respon mitokondria (siklus 1C) ngon sitoplasma (biosintesis serin) nyang diinduksi oleh stres secara sinergis ngon peningkatan aterosklerosis lam siklus TCA keu membentuk ulang metabolisme neuronal.
PN nyang defisiensi OXPHOS umu 8 minggu jeut geupeutheun aktivitas eksitasi frekuensi tinggi ngon mengalami rekoneksi metabolisme nyang signifikan keu geukompensasi disfungsi mitokondria. Penemuan nyoe ji timbulkan kemungkenan nyang menarik bahwa bahkan bak saat nyoe, sel-sel nyoe mungken chit ji teurimong intervensi terapeutik keu ji tunda atawa ji cegah neurodegenerasi. Teulat. Kamoe meuseuleusoe kemungkenan nyoe melalui dua intervensi independen. Lam metode phon, kamoe meurancang vektor virus terkait adeno (AAV) nyang bergantung bak Cre sampoe MFN2 jeut diekspresikan secara selektif lam PN nyang defisiensi OXPHOS lam vivo (Gambar S7A). AAV nyang menyandikan MFN2 ngon gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) geuverifikasi lam kultur neuron primer lam vitro, nyang menyebabkan MFN2 geuekspresikan ngon cara nyang bergantung bak Cre ngon geupeuseulamat morfologi mitokondria, sampoe mencegah neuromutasi bak Mfn2KO ngon Gambar S7). Seulaen nyan, kamoe peugot eksperimen in vivo untuk stereotaktik meusampaikan Mfn2-AAV umu 8 minggu keu korteks otak Mfn2cKO dan tikoh kontrol, dan menganalisis tikoh umu 12 minggu (Gambar 4A). Tikoh Mfn2cKO nyang geurawat nyan mate (Gambar 1, A dan B) (16). Transduksi virus lam vivo geu peuhase ekspresi selektif PN bak padum-padum boh lingkaran otak kecil (Gambar S7, G ngon H). Suntikan AAV kontrol nyang hanya mengekspresikan mCherry (Ctrl-AAV) hana efek signifikan bak tingkat neurodegenerasi bak binatang Mfn2cKO. Sebalik jih, analisis Mfn2cKOs nyang ditransduksi ngon Mfn2-AAV geupeuleumah efek peulindong nyang signifikan dari lapisan sel PN (Gambar 4, B ngon C). Secara khusus, kepadatan neuron deuh jih karap hana jeut dibedakan ngon binatang kontrol (Gambar 4, B ngon C, ngon Gambar S7, H ngon I). Ekspresi MFN1 tapi kon MFN2 sama-sama efektif lam menyelamatkan kematian neuron (Gambar 4C dan Gambar S7, C dan F), yang menunjukkan bahwa ekspresi MFN1 ektopik jeut secara efektif melengkapi kekurangan MFN2. Analisis leubeh lanjot bak tingkat PN tunggal menunjukkan bahwa Mfn2-AAV sebagian rayeuk menyelamatkan ultrastruktur mitokondria, menormalkan tingkat mtDNA, dan membalikkan ekspresi tinggi penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C sampoe E ). Inspeksi visual bak tikoh Mfn2cKO nyang ka geupeuseulamat lam keuadaan istirahat geupeuleumah bahwa postur dan gejala motorik (gerakan S1 sampoe S3) ka meutamah get. Kesimpulan jih, eksperimen nyoe menunjukkan bahwa penundaan reintroduksi MFN2 keu PNs nyang brat defisiensi OXPHOS cukop keu membalikkan konsumsi mtDNA ngon menginduksi aterosklerosis, sehingga mencegah degenerasi akson ngon kematian neuron lam vivo.
(A) Skema nyang geupeuleumah jadwal eksperimen keu suntikan AAV nyang mengkode MFN2 watee jalur metabolisme nyang ditunjukkan diaktifkan. (B) Foto konfokal perwakilan bagian otak otak umu 12 minggu nyang ditransduksi ngon tikoh Mfn2cKO bak 8 minggu dan dibri label ngon antibodi anti-Calbindin. Uneun: Skala serat akson. Skala zoom akson nakeuh 450 ngon 75 μm. (C) Wi: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje lam loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varians saboh arah; n = 3 tikoh). Unen: analisis fokus mtDNA lam PN nyang ditransduksi bak minggu 12 (t-test hana meupasang; n = 6 sel dari lhee boh tikoh). * P <0,05; ** P <0,01 nyan. (D) Mikrograf elektron transmisi perwakilan PN bagian otak Mfn2cKO nyang ditransduksi ngon vektor virus nyang ditunjukkan. Topeng warna pink nyan geugamba wilayah nyang jiduek le dendrit, ngon peut sagoe nyang meuwarna kuneng nyan geugamba zoom nyang ka geubri di siblah uneun; n mewakili inti. Batang skala, 1μm. (E) menunjukkan contoh pewarnaan PCx pada PN yang ditransduksi pada 12 minggu. Batang skala, 20μm. OE, ekspresi nyang leubèh; FC, lipat ubah.
Akhe jih, kamoe menyelidiki penteng jih kelangsungan udep sel nyang diinduksi peroksidase bak PN nyang ka mengalami disfungsi OXPHOS. Kamoe meuhasekan mCherry nyang menyandikan AAV-shRNA (RNA jepit rambut paneuk) nyang secara khusus ji targetkan mRNA PCx tikoh (AAV-shPCx), ngon ji suntik virus atawa kontrol nyang ji reubot (AAV-scr) u dalam otak tikus Mfn2cKO. Suntikan nyan geupeugot bak minggu keupeut umu (Gambar 5A) untuk meucapai knockdown PCx nyang efektif lam periode watee ekspresi PCx meutamah (Gambar 3C) dan lapisan sel PN mantong utoh (Gambar 1A). Perlu diperhatikan bahwa peutron PCx (Gambar S8A) menyebabkan percepatan kematian PN nyang signifikan, nyang merupakan saboh-saboh jih lingkaran infeksi nyang terbatas (Gambar 5, B dan C). Untuk meuphom mekanisme efek metabolisme nyang dipicu le PCx up-regulasi, kamoe meurunoe status redoks PN lheuh knockdown PCx ngon biosensor optik nyang dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan secara bersamaan (Gambar S8, B sampoe D) untuk mengevaluasi glutathion dari peptida relatif). Kemudian, kamoe peuget mikroskopi pencitraan seuumur udep fluoresensi dua foton (FLIM) lam irisan otak akut Mfn2cKO umu 7 minggu atawa kontrol littermates untuk mendeteksi perubahan potensial status redoks sitoplasma lheuh verifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E sampoe G). Analisis nyan geupeuleumah peningkatan signifikan lam keadaan oksidasi saboh PN Mfn2cKO nyang hana ekspresi PCx, nyang beda ngon neuron kontrol atawa PN Mfn2cKO nyang hanya mengekspresikan shRNA nyang ka geu-acak (Gambar 5, D ngon E). Bak watee ekspresi PCx diatur, persentase PN Mfn2cKO nyang menunjukkan keadaan nyang brat teroksidasi meningkat leubeh dari lhee kali (Gambar 5E), menunjukkan bahwa regulasi PCx mempertahankan kapasitas redoks neuron nyang degenerasi.
(A) Skema nyang geupeuleumah jadwal eksperimen keu geusuntik AAV nyang mengkode shPCx watee jalur metabolisme nyang geutunyok geuaktifkan. (B) Foto konfokal perwakilan bagian otak kecil umu 8 minggu bak tikoh Mfn2cKO nyang ditransduksi dan dibri label ngon antibodi anti-kalsineurin bak 4 minggu. Batang skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje lam loop nyang ditransduksi AAV (analisis varians saboh arah; n = 3 sampoe 4 tikoh). Data dinyatakan seubagoe rata-rata±SEM; ***P<0,001 nyan. (D) Gambar FLIM perwakilan menunjukkan rata-rata masa udep PN 7 minggu yang mengekspresikan sensor redoks glutathione Grx1-roGFP2 di dalam kondisi eksperimen yang ditentukan. Rasio LUT (tabel mita): interval watee kelangsungan udep (lam pikodetik). Batang skala, 25μm. (E) Histogram nyan geupeuleumah distribusi nilai masa udep Grx1-roGFP2 dari (D) (n=158 sampoe 368 sel lam dua boh tikoh lam tiep-tiep kondisi). Bagan pie di ateuh tiep-tiep histogram: geupeuleumah jumlah sel-sel nyang na nilai masa udep nyang signifikan leubeh panyang (mirah, teroksidasi) atawa leubeh paneuk (biru, meukureng), nyang leubeh dari 1 SD dari nilai rata-rata masa udep lam CTRL-AAV-scr. (F) Model nyang geuusulkan geupeuleumah efek peulindong upregulasi PCx neuronal.
Mandum-mandum, data nyang kamoe bri di sinoe menunjukkan bahwa ekspresi ulang MFN2 jeut sepenuh jih menyelamatkan PN lanjutan deungon defisiensi OXPHOS nyang parah, kehabisan mtDNA nyang parah, dan morfologi lagee ista nyang that abnormal, deungon lagee nyan geubri kemajuan nyang sabe-sabe bahkan lam peunyaket lanjutan. Neurodegenerasi geubri bukti reversibel dari tahap segolom mate sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme nyoe leubeh lanjot ditekankan oleh kemampuan neuron untok menginduksi aterosklerosis (pengawalan ulang siklus TCA), nyang menghambat ekspresi PCx bak PN nyang hana OXPHOS ngon meningkatkan kematian sel, sampoe berperan melindungi (Gambar 5F).
Lam penelitian nyoe, kamoe meubri bukti bahwa respon PNs keu disfungsi OXPHOS nakeuh secara bertahap konvergen keu aterosklerosis siklus TCA melalui jalur aktivasi diferensial nyang diaktifkan le program metabolisme. Kamoe mengkonfirmasi analisis proteomik ngen le metode pelengkap ngon mengungkapkan bahwa watee ditantang oleh disfungsi mitokondria nyang parah, neuron na bentuk elastisitas metabolisme nyang segolom jih hana diketahui. Keu kejutan geutanyoe, mandum proses kabel ulang hana teunte menandai keadaan metabolisme terminal nyang menyertai neurodegenerasi secara bertahap ngon hana terbalik, tapi data geutanyoe menunjukkan bahwa nyan mungken merupakan neuron pemeliharaan bahkan bak tahap segolom kematian sel Mekanisme kompensasi fungsional. Temuan nyoe menunjukkan bahwa neuron na tingkat plastisitas metabolisme nyang cukop rayeuk lam tuboh. Fakta nyoe membuktikan bahwa reintroduksi MFN2 selanjut jih jeut membalikkan ekspresi penanda metabolisme kunci dan mencegah degenerasi PN. Seubalek jih, jih ji peutheun aterosklerosis ngon ji peu bagah saraf. transeksual nyang.
Salah saboh temuan nyang paleng menarik lam penelitian kamoe adalah bahwa PN nyang hana OXPHOS jeut memodifikasi metabolisme siklus TCA deungon mengatur enzim nyang secara khusus merangsang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme nakeuh ciri umum sel kanker, nyang bergantung bak glutamin untok melengkapi perantara siklus TCA untok menghasilkan setara reduksi, nyang mendorong rante pernapasan ngon mempertahankan produksi prekursor biosintesis lipid ngon nukleotida (39, 40). Saboh penelitian baroe-baroe nyoe menunjukkan bahwa bak jaringan tepi nyang mengalami disfungsi OXPHOS, rekoneksi metabolisme glutamin/glutamat pih merupakan fitur nyang menonjol (5, 41), dimana arah tamong glutamin lam siklus TCA bergantung bak Kareuna parah luka OXPHOS (41). ). Namun, kureung bukti nyang jeulah teuntang kesamaan plastisitas metabolisme neuronal lam tuboh ngon kemungkenan relevansi jih lam konteks peunyaket. Lam penelitian in vitro baroe-baroe nyoe, neuron kortikal primer terbukti memobilisasi kolam glutamat keu neurotransmisi, sehingga mempromosikan metabolisme oksidatif ngon aterosklerosis lam kondisi stres metabolisme. Perlu diperhatikan bahwa di miyup inhibisi farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dipeucaya untuk mempertahankan sintesis oksaloasetat lam neuron granul otak kecil nyang dibudidayakan (34). Namun, relevansi fisiologis dari mekanisme nyoe keu jaringan otak (di pat aterosklerosis dipeucaya terutama terbatas bak astrosit) mantong na signifikansi fisiologis nyang peunteng (43). Lam hai nyoe, data kamoe menunjukkan bahwa PN nyang ka rusak le OXPHOS lam tuboh jeut geugantoe keu degradasi BCAA ngon karboksilasi piruvat, nyang merupakan dua sumber utama suplementasi perantara kolam TCA. Meskipun kontribusi nyang diduga katabolisme BCAA keu metabolisme energi neuronal kaleuh diusulkan, selaen peran glutamat ngon GABA keu neurotransmisi (44), mantong hana bukti keu mekanisme nyoe lam vivo. Kareuna nyan, mudah that ta spekulasikan bahwa PN nyang hana berfungsi jeut secara otomatis geukompensasi konsumsi perantara TCA nyang geudorong le proses asimilasi deungon meningkatkan aterosklerosis. Seucara kusuih, upregulasi PCx mungken dipeurelekan untok mempertahankan peningkatan permintaan asam aspartat nyang kaleuh dipeudeuh lam sel proliferasi deungon disfungsi mitokondria. Namun, analisis metabolomik kamoe hana mengungkapkan perubahan signifikan lam tingkat keadaan stabil asam aspartat lam Mfn2cKO PNs (Gambar S6A), nyang diperkirakan mencerminkan pemanfaatan metabolisme asam aspartat nyang berbeda antara sel proliferasi ngon neuron pasca-mitosis. Meskipun mekanisme nyang teupat dari upregulasi PCx lam neuron nyang hana berfungsi lam vivo teutap harus dicirikan, kamoe menunjukkan bahwa respon prematur nyoe berperan peunteng lam mempertahankan keadaan redoks neuron, nyang ditunjukkan lam eksperimen FLIM bak irisan otak kecil. Seucara khusus, mencegah PN dari PCx nyang mengatur jeut menyebabkan keadaan nyang leubeh teroksidasi ngon mempercepat kematian sel. Aktivasi degradasi BCAA ngon karboksilasi piruvat kon cara untuk geucirikan jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Oleh karena nyan, awaknyan deuh jih jeut keu fitur prioritas neuron nyang defisiensi OXPHOS, bah pih kon saboh-saboh jih fitur, nyang peunteng keu neurodegenerasi. .
Penyakit serebelum nakeuh saboh jenis peunyaket neurodegeneratif nyang heterogen nyang biasa jih meunyata seubagoe ataksia dan seureng that meurusak PN (46). Populasi neuron nyoe that rentan terhadap disfungsi mitokondria karena degenerasi selektif jih bak tikoh cukop keu mereproduksi le gejala motorik yang mencirikan ataksia spinoserebellar manusia (16, 47, 48). Menurot laporan, model tikoh transgenik ngen gen mutan nyan na hubungan ngen ataksia spinoserebel manusia ngon na disfungsi mitokondria (49, 50), ji teukankan penteng jih ji pelajari konsekuensi defisiensi OXPHOS bak PNPH. Oleh karena nyan, that cocok untuk secara efektif mengisolasi ngon meuruno populasi neuron nyang unik nyoe. Namun, mengingat bahwa PN that sensitif terhadap tekanan ngon menjelaskan proporsi nyang miyub dari mandum populasi sel otak kecil, keu le studi berbasis omics, pemisahan selektif awak nyan seubagoe mandum sel mantong jeut keu aspek nyang menantang. Meskipun karap hana mungken untuk meucapai kureung jih kontaminasi mutlak dari jenis sel laen (terutama jaringan dewasa), kamoe meugabongkan langkah disosiasi nyang efektif ngon FACS untuk meucapai jumlah neuron nyang layak nyang cukop untuk analisis proteomik hilir, ngon na cakupan protein nyang cukop tinggi nyang membandingkan data cerebel nyang membandingkan protein nyang cukop tinggi. (51). Deungon geupeutheun kelangsungan udep mandum sel, metode nyang kamoe seudiakan di sinoe hana mantong memungkenkan kamoe untuk memeriksa perubahan jalur metabolisme lam mitokondria, tapi cit untuk memeriksa perubahan rekan-rekan sitoplasma jih, nyang melengkapi penggunaan pengayaan label membran mitokondria nyang spesifik keu jenis sel mithox number (52, 53). Metode nyang kamoe jelaskan hana mantong berhubungan ngon studi sel Purkinje, tapi jeut deungon mudah diterapkan bak jenis sel peu manteng untuk mengatasi perubahan metabolisme lam otak nyang peunyaket, termasuk model laen dari disfungsi mitokondria.
Akhe jih, kamoe ka meuidentifikasi jendela terapeutik seulama proses penataan ulang metabolisme nyoe nyang jeut sepenuh jih membalikkan tanda-tanda kunci stres seluler ngon mencegah degenerasi neuron. Oleh kareuna nyan, memahami implikasi fungsional dari kabel ulang nyang dijelaskan di sinoe jeut geubri wawasan mendasar teuntang kemungkenan perawatan keu geupeutheun viabilitas neuronal seulama disfungsi mitokondria. Penelitian ukeu nyang bertujuan keu geubedah perubahan metabolisme energi lam jenis sel utak laen jih perle keu geubuka sepenuh jih penerapan prinsip nyoe keu peunyaket saraf laen jih.
Tikoh MitoPark ka geujelaskan seugolom jih (31). Tikoh C57BL/6N ngon gen Mfn2 nyang mengapit loxP ka geujelaskan seugolom jih (18) dan geusilang ngon tikoh L7-Cre (23). Keturunan heterozigot ganda nyang ji haselkan kemudian ji silangkan ngen tikoh homozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP keu ji haselkan knockout gen spesifik Purkinje keu Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Lam subset perkawinan, alel sorstop-mito-yFP gt (rosa26) geupeuturi melalui persilangan tambahan (20). Mandum prosedur binatang nyan geupeugot sesuai ngon pedoman Eropa, nasional ngon kelembagaan ngon geusetujui le LandesamtfürNatur dari Umwelt ngon Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westphalia, Jerman. Buet binatang pih ji ikot bimbingan Federasi Eropa Asosiasi Ilme Binatang Laboratorium.
Lheueh geubius dislokasi serviks ureung inong nyang teungoh mume, embrio tikoh geuisolasi (E13). Korteks nyan geubedah lam Larutan Sira Seimbang Hanks (HBSS) nyang geutamah ngon Hepes 10 mM dan geupeutroh bak Media Elang Modifikasi Dulbecco nyang na papain (20 U/ml) ngon sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan lam DMEM) dan dissosiasikan ngon cara pencernaan enzimatik. Ml) bak suhu 37°C seulama 20 minet, lheuh nyan geugileng seucara mekanis lam DMEM nyang geutamah ngon 10% serum bovine janin. Sel-sel dibi bak coverslips kaca nyang dilapisi ngen polilisin bak kepadatan 2×106 per hidangan kultur 6 cm atawa bak kepadatan 0,5×105 sel/cm2 untuk analisis pencitraan. Lheueh 4 jeum, media nyan geugantoe ngon media bebas serum Neurobasal nyang na suplemen B27 1% ngon GlutaMax 0,5 mM. Neuron leuhnyan dipeutheun bak suhu 37°C ngon 5% CO2 seupanyang percobaan, ngon dijok makan sige seminggu. Untuk ji induksi rekombinasi lam vitro, 3 μl (hidangan kultur 24 mon) atawa 0,5 μl (piring 24 mon) dari vektor virus AAV9 berikut ji pakek untuk ji peu ubat neuron bak uroe keudua lam vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Tambahan, nomor katalog 105530-AAV9) dan AAV9.
DNA pelengkap tikoh Mfn1 ngon Mfn2 (maseng-maseng ji peuroleh dari plasmid Addgene #23212 ngon #23213) ji tandai ngen urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) bak ujung C, ngon ji peusatu ngen mCherry lam bingkai melalui urutan T2A. Grx1-roGFP2 nakeuh hadiah dari TP Dick DFKZ. Deungon geu gantoe kaset tdTomato geu pakek metode kloning konvensional, kaset nyan geu subkloning u dalam tuleng punggong pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor referensi Addgene 28306) untuk geu peuhase Vektor fleks-mceri-t2a-mfn1-v5 dan paav-cag-fleks-grx-rogFP2. Cara nyang sama dipakek untuk meuhasekan vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Untuk menghasilkan konstruksi AAV-shPCx, diperlukan vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- 3′) Dimiyub kendali promotor U6, mCherry geupake dimiyub kendali promotor CMV. Produksi vektor AAV bantu nyan geupeugot meunurot peutunyok pabriek (Cell Biolabs). Singkat jih, pakek plasmid transfer nyang jiba mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara sementara Transfeksi sel 2MFCV2-V5-2). atawa gen pengkode Grx-roGFP2, seureuta pengkode protein kapsid AAV1 ngon protein asesoris Plasmid kemasan, geupake metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasar nyan jiteumee ngon siklus beku-cair lam mandi es/etanol thoe ngon sel-sel nyang ji lisis lam salin penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnikan ngen ultrasentrifugasi gradien yodiksanol nyang hana meusambong (24 jeum bak 32.000 rpm ngon 4°C) ngon dipeukonsentrasi deungon dipakek filter sentrifugal ultra-15 Amicon. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX diuko seucara reald5 (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 x 1013 GC/ml) dan AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 x 1012 GC/ml).
Neuron primer geukoh lam PBS 1x nyang lupie lagee es, geupelet, lheuh nyan geuhomogenkan lam 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat/penyangga lisis PBS nyang mengandung fosfatase ngon inhibitor protease (Roche). Kuantifikasi protein dipeuget ngen dipakek assay asam bisinkoninat (Thermo Fisher Ilmiah). Protein nyan leuh nyan ji pisahkan ngen elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, ngon leuh nyan ji peuget keu membran poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blok situs non-spesifik dan inkubasi ngen antibodi primer (eu Tabel S1 untuk detail) lam susu 5% lam TBST (saline penyangga Tris ngen Tween), langkah-langkah cuci dan antibodi sekunder lam TBST Inkubasi. Inkubasi ngen antibodi primer si malam bak suhu +4°C. Lheuh ta rhah, ta boh antibodi sekunder nyan seulama 2 jeum bak suhu ruangan. Seulaen nyan, ngon cara ji inkubasi blot nyang saban ngon antibodi anti-β-aktin, beban nyang saban ji konfirmasi. Deteksi ngon cara geuubah jeut keu kemia luminesen ngon geupeugot kemia luminesen (GE Healthcare).
Neuron nyang seugolom jih geuboh bak coverslip kaca geupeuteutap ngon 4% paraformaldehida (PFA)/PBS bak titek watee nyang ka geutentukan bak suhu ruangan seulama 10 minet. Peututop phon that jitembus ngon 0,1% Triton X-100/PBS seulama 5 minet bak suhu ruangan, lheuh nyan lam penyangga blok [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Bak uroe keudua, coverslips nyan geuraseu ngon penyangga blok dan geuinkubasi ngon antibodi sekunder konjugasi fluorofor nyang sesuai seulama 2 jeum bak suhu ruangan; akhe jih, sampel-sampel nyan geuraseu beutoi-beutoi lam PBS ngon 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) geulawan dan lheuh nyan geupeuteutap bak geser mikroskop ngon Aqua-Poly/Mount.
Tikoh (agam ngon inong) geubius ngon cara geusuntik ketamin (130 mg/kg) ngon xilazin (10 mg/kg) lam pruet dan geubri lam kulet ngon ubat peutheun sakét karprofen (5 mg/kg) , Dan geupeuduek lam alat stereotaktik (Kopd a ngon alat prang). Peuhah tengkorak dan pakek bor gigi untuk tipih bagian korteks otak kecil nyang sesuai ngon tulang mis (dari lambda: iku 1,8, lateral 1, sesuai ngon lobus IV dan V). Gunakan jarom jarum suntik nyang melengkung untuk deungon hati-hati tapeugot lubang ubeut bak tengkorak mangat bek meuganggu pembuluh darah di miyup. Lheueh nyan kapiler kaca nyang ka jigamba tipih nyan jipeutamong lam lubang mikro (dari -1,3 sampoe -1 bak sisi ventral dura mater), dan 200 sampoe 300 nl AAV jisuntik lam mikro-injektor (Narishige) ngon jarum suntik manual (Narishige tisure) bak periode teukanan sever100. jeundela 10 minit. Lheuh infus, tapeuduek kapiler nyan 10 minet teuk mangat virus nyan jeut menyebar sepenuh jih. Lheueh kapiler nyan ji tarek, kulet jih ji jahit ngon get-get mangat radang luka nyan leubeh kureung dan jeut keu binatang nyan puleh. Binatang nyan geurawat ngon analgesik (caspofen) seulama padum uroe lheuh operasi, lam watee nyan kondisi fisik jih geupantau deungon get dan lheuh nyan geu eutanasia bak titek watee nyang ka geunyatakan. Mandum prosedur geupeugot meunurôt pedoman Eropa, nasional dan kelembagaan dan ka geuseutujôh lé LandesamtfürNatur nibak Umwelt dan Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westphalia, Djeurman.
Binatang nyan geubius ngon ketamin (100 mg/kg) ngon xilazin (10 mg/kg), dan ateuh geuperfusi ngon PBS 0,1 M dilee, lheuh nyan ngon PFA 4% lam PBS. Jaringan nyan geubedah dan geupeuteutap lam 4% PFA/PBS si malam bak suhu 4°C. Saboh sikin nyang meugeta (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) geungui keu geupeusiap bagian sagital (teubai 50 μm) dari utak nyang teutap lam PBS. Kecuali meunyoe hana geupeugah laen, pewarnaan bagian-bagian nyang meuapong bebas geupeugot lagee nyang ka geubri gamba di ateuh (13) bak suhu ruangan ngon geuaduk. Singkat haba, phon, irisan nyang ka jiteumee ji permeabilisasi ngon 0,5% Triton X-100/PBS seulama 15 minet bak suhu ruangan; keu padum-padum boh epitope (Pcx ngon Shmt2), ngon lam penyangga tris-EDTA bak suhu 80°C (PH 9) geupeusuum irisan-irisan nyan seulama 25 minet nibak langkah nyoe. Seulaen nyan, bagian-bagian nyan geu inkubasi ngon antibodi primer (kalon Tabel S1) lam penyangga blok (3% BSA/PBS) bak suhu 4°C si malam ngon geu aduk. Uroe lheuh nyan, bagian-bagian nyan geuraseu ngon penyangga blok dan geuinkubasi ngon antibodi sekunder konjugasi fluorofor nyang sesuai seulama 2 jeum bak suhu ruangan; akhe jih, bagian-bagian nyan geuraseu beutoi-beutoi lam PBS, geubalaih ngon DAPI, lheuh nyan geupeuteutap ngon AquaPolymount Bak slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X atawa Lembar Cahaya Digital TCS, Mikrosistem Leica) nyang dipeuleungkap ngon laser cahaya puteh ngon laser ultraviolet 405 dioda dipakek keu geugamba sampel. Deungon menggairahkan fluorofor ngon meukumpoikan sinyal ngon Detektor Hibrida (HyDs), perangkat lunak LAS-X dipakek keu meukumpoikan gamba nyang meutumpok nyang sesuai ngon pengambilan sampel Nyquist lam mode urutan: keu panel non-kuantitatif, nyan sinyal nyang that dinamis (miseu jih, lam sel somatik ngon dendrit) mt Mode TerangR). Gating 0,3 sampoe 6 ns geubri keu geupeukureueng latar.
Pencitraan watee nyata sel-sel nyang ka geu-urut. Lheueh geupiléh lam media Neurobasal-A nyang meuasoe suplemen B27 1% ngon GlutaMax 0,5 mM, sel-sel langsong geubijeh bak geser kaca nyang meulapis poli-l-lisin (μ-Geser8 Nah, Ibidi, nomor katalog 80826) , Dan lheuh nyan geupeutheun bak suhu 1% CO2 sampoe 3.2. keu meu-ulang. Pencitraan wate nyata dipeuget bak mikroskop konfokal pemindaian laser Leica SP8 yeng dipeuleungkap deungen laser puteh, HyD, lensa objektif minyeuk 63×[1,4 bukaan numerik (NA)] ngen panggong peusuum.
Tikoh nyan bagah that geubius ngon karbon dioksida ngon geupoh ulee, utak ngon bagah that geucok dari tengkorak, ngon geukoh jeut keu teubai 200μm (untuk percobaan pelabelan Fi3C) atawa teubai 275μm (untuk dua percobaan foton) bagian sagital nyang geupeuasoe ngon bahan crece berikut The VHr50. Scientific, Walldorf, Jerman) geupeuasoe ngon zat-zat nyang na di miyup nyoe: 125 mM es lupie, jenuh karbon (95% O2 ngon 5% CO2) Ca2 rendah + cairan otak buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium m2. glukosa, CaCl2 0,5 mM ngon MgCl2 3,5 mM (tekanan osmotik 310 sampoe 330 mmol). Pindahkan irisan otak nyang ka jiteumee u dalam ruang pra-inkubasi nyang na Ca2 + ACSF nyang leubeh manyang (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa Ca2C m0, 1,0 mM d-glukosa). MgCl2) Sedang) pH 7,4 dan 310 sampoe 320 mmol).
Seulama proses pencitraan, irisan-irisan nyan dipinah u dalam ruang pencitraan khusus, dan percobaan dipeuget di miyup perfusi ACSF yang sabe-sabe bak suhu konstan 32° sampoe 33°C. Saboh mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Mikrosistem Leica) yeng dipeuleungkap deungen lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, ie), laser Ti: Safir (Visi Bunglon II, Koheren) dipakek untuk pencitraan irisan. Modul FLIM (PikoHarp300, PikoKuan).
FLIM dari grx1-rogfp2. Perubahan keadaan redoks sitoplasma PN geu uko ngen FLIM dua foton lam irisan otak sagital, di pat biosensor Grx1-roGFP2 geu targetkan PN. Lam lapisan PN, bidang akuisisi geupiléh kira-kira 50 sampoë 80 μm di miyup permukaan slice keu geupeupastikan bahwa na PN nyang layak (yaitu, kureuëng struktur manik-manik atawa perubahan morfologi neuron di seupanyang dendrit) ngon sensor roGFP2 positif ganda ngon pengkode PCx mSakura). Kumpoi gamba tumpukan tunggal ngon zoom digital 2x [panyang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 boh piksel]. Deteksi: HyD internal, kelompok filter fluoresein isotiosianat (FITC)] ngon rata-rata gamba lam watee 2 sampoe 3 minet dipakek untuk memastikan bahwa foton nyang cukop dikumpoi (1000 foton total) untuk pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 ngon verifikasi kondisi FLIM geupeugot ngon cara geupantau nilai masa udep roGFP2 watee geutamah H2O2 eksogen 10 mM keu perfusi ACSF (untuk memaksimalkan oksidasi, nyang meuhasekan peningkatan masa udep), ngon lheuh nyan geutamah mrethiol reduksi, nyang meuhase keu meunuron umu) (Gambar S8, D sampoe G). Gunakan perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 untuk menganalisis hasil yang diperoleh, paskan kurva peluruhan eksponensial tunggal dari seluruh gambar ke IRF yang diuko (fungsi respon instrumen), dan χ2 adalah kira-kira 1. Untuk menghitung masa udep saboh PN, masker secara manual adalah masa udep each di sekitar saraf . geungui keu kuantifikasi.
Analisis potensi mitokondria. Lheueh bagian akut nyan geu inkubasi ngon 100 nM TMRM langsong geutamah keu ACSF nyang ka geuperfusi seulama 30 minet, perubahan potensial mitokondria PN geu uko ngon mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM geupeugot ngon cara geu-eksitasi probe bak 920 nm ngon geungui HyD internal (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) keu geukumpoi sinyal; deungon geungui panyang gelombang eksitasi nyang saban tapi geungui HyD internal nyang beda (FITC :525/50) keu geugamba mtYFP. Gunakan plug-in Kalkulator Gambar ImageJ keu evaluasi potensi mitokondria bak tingkat sel tunggal. Singkat jih, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) dipakek untuk mengidentifikasi wilayah mitokondria yang menunjukkan sinyal TMRM di Purkinje Somali dalam gamba konfokal tumpukan tunggal dari saluran yang sesuai. Kemudian luah piksel lam masker nyang dihasekan diuko, ngon kemudian dinormalisasi bak gamba tumpukan tunggal ambang batah nyang sesuai dari saluran mtYFP untok meuteumee fraksi mitokondria nyang menunjukkan potensi mitokondria.
Gambar nyan dipeuget ngen perangkat lunak Huygens Pro (Pencitraan Volume Ilmiah). Keu gamba ubin nyang ka geu-scan, montase saboh ubin geupeugot ngon geungui algoritma jahitan otomatis nyang ka geubri le perangkat lunak LAS-X. Lheueh kalibrasi gamba, neungui ImageJ ngon Adobe Photoshop keu neuproses gamba leubeh lanjot ngon neuseusuaikan trang ngon kontras seucara seragam. Pakèk Adobe Illustrator keu peusiapan grafik.
Analisis fokus mtDNA. Jumlah lesi mtDNA geu uko bak bagian cerebellum nyang geubri label ngen antibodi terhadap DNA ngen mikroskop konfokal. Tiëp-tiëp wilayah target geupeugot keu tuboh sel ngon inti tiep-tiep sel, ngon wilayah maseng-maseng geuhitong ngon geungui plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kureung luah inti dari luah tuboh sel untuk meuteumee luah sitoplasma. Akhe jih, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) dipakek untuk secara otomatis geu uko titik DNA sitoplasma nyang geutunyok mtDNA bak gamba ambang batah, dan hasee nyang dipeuroleh dinormalisasi keu rata-rata PN tikoh CTRL. Hase jih dinyatakan seubagoe jumlah rata-rata nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein. Gunakan plug-in Kalkulator Gambar ImageJ untuk evaluasi ekspresi protein lam PN bak tingkat sel tunggal. Singkat jih, lam gamba konfokal lapisan tunggal dari saluran nyang sesuai, melalui persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daerah mitokondria nyang menunjukkan imunoreaktivitas terhadap antibodi tertentu di Purkina diidentifikasi. Kemudian luah piksel lam masker nyang dihasekan diuko, ngon kemudian dinormalisasi bak gamba tumpukan tunggal ambang batah nyang sesuai dari saluran mtYFP untok meurumpok fraksi mitokondria dari protein nyang dipeudeuh.
Analisis kepadatan sel Purkinje. Plug-in Cell Counter dari ImageJ dipakek untuk dievaluasi kepadatan Purkinje deungon cara dibagi jumlah sel Purkinje yang dihitong deungon panyang encin otak yang diduek le sel-sel yang dihitong.
Peusiap dan peusapat sampel. Utak dari kelompok kontrol ngon tikoh Mfn2cKO geupeuteutap lam 2% PFA/2,5% glutaraldehida lam penyangga fosfat 0,1 M (PB), ngon lheuh nyan bagian koronal geupeusiap ngon geupake silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Tebal 50 sampoe penyangga μm1 o60). tetraoksida ngon 1,5% kalium ferosianida bak suhu ruangan seulama 1 jeum. Bagian-bagian nyan geuraseu lhee goe ngon ie suling, lheuh nyan geuwarnai ngon etanol 70% nyang na 1% uranil asetat seulama 20 minet. Bagian-bagian nyan ludoe didehidrasi lam alkohol bertingkat ngen dipeutamong lam resin epoksi Durcupan ACM (resin pengecoran Araldite M) (Ilme Mikroskopi Elektron, nomor katalog 14040) antara geser kaca yeng dilapeh silikon, ngen akhe jih bak suhu 60°C Polimerisasi dalam tungku. Area korteks otak kecil dipileh dan bagian ultratipih 50 nm dikoh bak Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) dan dicok bak kisi celah teumaga 2×1 mm yang dilapisi ngen pilem polistirena. Bagian-bagian nyan geuwarnai ngon larutan uranil asetat 4% lam H2O seulama 10 minet, geuraseu ngon H2O padum-padum go, lheuh nyan ngon sitrat timah Reynolds lam H2O seulama 10 minet, lheuh nyan geuraseu ngon H2O padum-padum go. Mikrograf dicok ngen mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Serikat) dipakek kamera digital TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Amerika Serikat). Jerman).
Bak tikoh nyang ka terinfeksi AAV, utak geupisah dan geukoh jeut keu bagian sagital nyang tebal jih 1 mm, dan otak kecil geupareksa ngon geupake mikroskop fluoresensi untuk geuidentifikasi encin nyang ka terinfeksi AAV (yaitu, mCherry nyang mengekspresikan). Hanya eksperimen dipat injeksi AAV meuhase efisiensi transduksi nyang that tinggi dari lapisan sel Purkinje (yaitu karap mandum lapisan) setidak jih dua encin cerebellum meuturot-turot nyang dipakek. Loop nyang ditransduksi AAV di mikrodiseksi untuk pasca-fiksasi si malam (4% PFA ngon 2,5% glutaraldehida lam penyangga kakao 0,1 M) ngon diproses leubeh lanjot. Untuk penyematan EPON, jaringan teutap dicuci ngen penyangga koko natrium 0,1 M (Applichem), dan diinkubasi ngen 2% OsO4 (os, Layanan Sains; Caco) lam penyangga koko natrium 0,1 M (Applichem) 4 Jam, lheuh nyan dicuci seulama 2 jam. Neu ulang 3 kali ngon penyangga cocamide 0,1 M. Seulaen nyan, rangkaian etanol nyang meutamah dipakek untuk ji inkubasi tiep-tiep larutan etanol bak suhu 4°C seulama 15 minet untuk ji dehidrasi jaringan. Jaringan nyan dipinah keu propilen oksida dan di inkubasi si malam lam EPON (Sigma-Aldrich) bak suhu 4°C. Peuduek tisu lam EPON segar bak suhu ruangan seulama 2 jeum, lheuh nyan tapeugot bak suhu 62°C seulama 72 jeum. Gunakan ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) ngen sikin berlian (Diatome, Biel, Swiss) untuk koh bagian ultratipih 70 nm, ngen noda deungen 1,5% uranil asetat seulama 15 minet bak suhu 37°C, ngen noda deungen larutan sitrat timah 4 minet. Mikrograf elektron nyan geucok ngon geungui mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) nyang geupeuleungkap ngon kamera OneView 4K 16-bit (Gatan) ngon perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Untuk analisis, mikrograf elektron dipeuroleh deungen zoom digital 5000× atau 10.000×.
Analisis morfologi bak mitokondria. Untuk mandum analisis, kontur mitokondria individu digariskan secara manual lam gamba digital dipakek perangkat lunak ImageJ. Parameter morfologi nyang meulaén-laén geuanalisis. Kepadatan mitokondria dinyatakan seubagoe persentase nyang dipeugot deungon cara dibagi total luah mitokondria tiep-tiep sel deungon luah sitoplasma (luah sitoplasma = luah sel-luah inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria dihitong deungon rumus [4π∙2(luas)]./perimeter. Morfologi ista mitokondria dianalisis ngon dibagi jeut keu dua kategori ("tubular" ngon "lepuh") sesuai ngon bentuk utama jih.
Analisis jumlah autofagosom/lisosom ngon kepadatan. Gunakan perangkat lunak ImageJ untuk secara manual geugambarkan kontur tiep-tiep autofagosom/lisosom lam gamba digital. Luas autofagosom/lisosom dinyatakan sebage persentase nyang dihitong ngen membagi total luas struktur autofagosom/lisosom bak tiep sel ngen luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kepadatan autofagosom/lisosom geuhitong ngon geubagi jumlah total ngon jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (lam hai luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Pelabelan untuk pembagian akut dan persiapan sampel. Untuk eksperimen nyang peureulee pelabelan glukosa, neupinah irisan utak akut u dalam ruang pra-inkubasi, nyang na karbon jenuh (95% O2 ngon 5% CO2), Ca2 + ACSF tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium m3O fosfat, 1,25 mM natrium fosfat. 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 dan 2,0 mM MgCl 2, disesuaikan dengan pH 7,4 dan 310 hingga 320 mOsm), dimana glukosa adalah 13 C 6- Penggantian glukosa (Eurisotop, nomor katalog63-1). Untuk eksperimen nyang peureulee pelabelan piruvat, dipinah irisan otak akut keu Ca2 + ACSF nyang leubeh manyang (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa Ad2C m01). MgCl2, tapeugot ngon pH 7,4 ngon 310 sampoe 320mOsm), ngon tapeutamah 1mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi bagian-bagian nyan seulama 90 minet bak suhu 37°C. Bak akhe percobaan, bagian-bagian nyan bagah that ji rhah ngon larutan ie (pH 7,4) nyang na amonium karbonat 75 mM, lheuh nyan ji homogenkan lam 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: ie. Lheueh bagian-bagian nyan ji inkubasi ateuh es seulama 30 minet, sampel ji sentrifugasi bak 21.000 g seulama 10 minet bak suhu 4°C, dan supernatan nyang jeulah nyan ji thoe lam konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit tho nyang dihasekan disimpan bak suhu -80°C sampoe dianalisis.
Analisis spektrometri massa kromatografi caer dari 13 asam amino nyang geubri label C. Untuk analisis spektrometri massa kromatografi cair (LC-MS), pelet metabolit nyan geususpensi lom lam 75μl ie grade LC-MS (Honeywell). Lheueh sentrifugasi bak 21.000 g seulama 5 minet bak suhu 4°C, 20 μl supernatan nyang ka geuklarifikasi geupake keu analisis fluks asam amino, seudangkan ekstrak nyang laen langsong geupake keu analisis anion (eu di miyup). Analisis asam amino geupeugot ngon geungui protokol derivatisasi benzoil klorida nyang ka geubri gamba dilee (55, 56). Lam langkah phon, 10 μl natrium karbonat 100 mM (Sigma-Aldrich) geutamah keu 20 μl ekstrak metabolit, lheuh nyan 10 μl benzoil klorida 2% (Sigma-Aldrich) geutamah keu ACN grade LC. Sampel nyan diputar siat lheuh nyan disentrifugasi bak 21.000 g seulama 5 minet bak suhu 20°C. Pindahkan supernatan nyang ka geupeugleh u dalam botol autosampler 2 ml ngon sisipan kaca keurucot (volume 200 μl). Sampel-sampel nyan geuanalisis ngon geungui sistem LC kinerja ultra-tinggi Acquity iClass (Ie) nyang geuhubong ngon spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Orbitrap Medan Ultra Lambong) (Thermo Fisher Scientific). Untuk analisis, 2μl sampel derivatisasi disuntikkan ke dalam kolom silika T3 kekuatan tinggi 100×1,0 mm (Waters) nyang mengandung partikel 1,8μm. Laju aliran jih 100μl/min, ngon sistem penyangga nyan nakeuh penyangga A (10 mM amonium format ngon 0,15% asam formik lam ie) ngon penyangga B (ACN). Gradien jih lagee nyoe: 0%B bak 0 minet; 0%B. 0 sampoe 15% B bak 0 sampoe 0,1 minet; 15 sampoe 17% B bak 0,1 sampoe 0,5 minet; B bak 17 sampoe 55% bak 0,5 sampoe 14 minet; B bak 55 sampoe 70% bak 14 sampoe 14,5 minet; bak 14,5 sampoë 70 sampoë 100% B bak 18 minèt; 100% B bak 18 sampoe 19 minet; 100 sampoe 0% B bak 19 sampoe 19,1 minet; 0% B bak 19,1 sampoe 28 minet (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi lam mode ionisasi positif ngon rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 sampoe 750. Resolusi nyang diterapkan nakeuh 60.000, ngon target ion kontrol keuntungan (AGC) nyang jiteumee nakeuh 3×106, ngon watee ion maksimum milli0se1. Sumber ionisasi elektrospray nyang geupeusuum (ESI) meuoperasi bak teugangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara sarung 60 AU (unit arbitrer), ngon aliran udara tambahan 20 AU. 250°S. Lensa S nyan geuset bak 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS asam organik nyang geubri label 13C. Endapan metabolit nyang mantong na (55μl) geuanalisis ngon geungui sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Termo Fisher Ilmiah) nyang geuhubong ngon spektrometer massa QE-HF (Termo Fisher Ilmiah). Singkat jih, 5μl ekstrak metabolit disuntikkan lam kolom Dionex IonPac AS11-HC nyang dipeuleungkap ngon HPLC (2 mm×250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Ilmiah) lam mode loop parsial push-in ngon rasio isian 1. )on. Kolom jaga dionex ionpac ag11-hc (2 mm x 50 mm, 4 μm, ilmiah termo nelayan). Suhu kolom geupeutheun bak 30°C, ngon autosampler geu-set bak 6°C. Gunakan kartrid kalium hidroksida yeng disediakan deungen ie deionisasi untuk meuhasekan gradien kalium hidroksida melalui generator eluen. Peumisah metabolit bak laju aliran 380μl/min, tapeulaku gradien lagee nyoe: 0 sampoe 3 minet, KOH 10 mM; 3 sampoe 12 minet, KOH 10 sampoe 50 mM; 12 sampoe 19 minet, 50 sampoe 100 mM KOH; 19 sampoe 21 minet , KOH 100 mM; 21 sampoe 21,5 minet, 100 sampoe 10 mM KOH. Kolom nyan geu seimbangkan lom di miyup KOH 10 mM seulama 8,5 minet.
Metabolit nyang dielusi nyan digabongkan ngon aliran suplemen isopropanol 150μl/min lheuh kolom lheuh nyan diarahkan keu spektrometer massa resolusi tinggi nyang beroperasi lam mode ionisasi negatif. MS teungoh ji pantau rentang massa dari m/z 50 sampoe 750 ngon resolusi 60.000. AGC geuset keu 1×106, ngon watee ion maksimum geujaga bak 100 ms. Sumber ESI nyang ka geupeusuum nyan geuoperasikan bak tegangan semprotan 3,5 kV. Peuatoe nyang la'én nibak sumber ion nakeuh lagèe nyoe: suhu kapiler 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU bak 300°C, ngon lensa S geu-atur bak 60 AU.
Analisis data metabolit nyang geubri label 13C. Gunakan perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Ilmiah Termo Fisher) keu analisis data rasio isotop. Identitas tiep-tiep senyawa diverifikasi le senyawa referensi nyang jeut diandalkan ngon dianalisis seucara independen. Untuk geupeugot analisis pengayaan isotop, luah kromatogram ion nyang diekstraksi (XIC) dari tiep isotop 13C (Mn) diekstraksi dari [M + H] +, di pat n nakeuh jumlah karbon senyawa target, nyang dipakek untuk menganalisis asam amino atawa [ MH] + dipakek untuk menganalisis anion. Akurasi massa XIC kureuëng nibak limong bagian per juta, ngon akurasi RT nakeuh 0,05 minèt. Analisis pengayaan dipeuget deungen meuhitong rasio seutiap isotop yeng dideteksi deungen jumlah mandum isotop senyawa yeng sesuai. Rasio-rasio nyoe geubri seubagoe nilai persentase keu tiep isotop, ngon hase jih dinyatakan seubagoe pengayaan persen molar (MPE), lagee nyang ka geujelaskan sigolom jih (42).
Pelet neuron nyang ka beku nyan geu homogenkan lam metanol 80% nyang lupie lagee es (v/v), geu putar, ngon geu inkubasi bak suhu -20°C seulama 30 minet. Vortex lom sampel nyan dan aduk bak suhu +4°C seulama 30 minet. Sampel nyan disentrifugasi bak suhu 21.000 g seulama 5 minet bak suhu 4°C, lheuh nyan supernatan nyang dihase dikumpoi dan dipeuthoe ngon dipakek konsentrator SpeedVac bak suhu 25°C untuk dianalisis selanjut jih. Lagee nyang ka geujelaskan di ateuh, analisis LC-MS geupeugot bak asam amino sel nyang ka geupiléh. Deungon geungui TraceFinder (versi 4.2, Termo Fisher Ilmiah), analisis data geupeugot deungon geungui massa monoisotop nibak tiep-tiep senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit geupeugot ngon paket perangkat lunak praprosesCore (57).
Persiapan slice. Tikoh nyan bagah that ji bius ngon karbon dioksida ngon ji poh ulee, utak jih bagah that ji peuteubiet dari tengkorak, ngon sikin getar nyang asoe jih es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) ji pakek keu ji koh jeut keu 300 sampoe 375 μm karbon se5d. CO2) Ca2 + ACSF rendah (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM, CaCl2 1,0 mM dan Adju 6,0 mM MgCl372. mOsm). Pindahkan irisan otak yang diperoleh ke dalam ruangan yang mengandung Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM pH2l2l dan Ca32 mM 4,0 mM. dan 310 sampoë 320 mOsm). Simpan slice-slice nyan 20 sampoe 30 minet mangat jeut dipeugot lom sigohlom direkam.
rekaman nyang. Saboh panggong mikroskop nyang dipeuleungkap ngon ruang rekaman teutap ngon lensa objektif immersi ie 20x (Scientifica) dipakek keu mandum rekaman. Sel Purkinje nyang diduga geuidentifikasi ngen (i) ukuran tuboh, (ii) lokasi anatomi otak kecil, ngon (iii) ekspresi gen reporter mtYFP fluoresen. Pipet patch deungon daya tahan ujong 5 sampoe 11 megohm ditarek u luwa le kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Produk Sains, Hofheim, Jerman) dan pipet horizontal Instrumen (P-1000). Mandum rekaman nyan geupeugot le penguat klem patch npi ELC-03XS (npi elektronik GmbH, Tam, Jerman), nyang geukontrol le perangkat lunak Signal (versi 6.0, Elektronik Cambridge, Cambridge, Inggréh). Eksperimen nyan geucatat bak laju sampling 12,5 kHz. Sinyal nyan geusaring ngon dua boh filter Bessel short-pass ngon frekuensi cutoff maseng-maseng 1,3 ngon 10 kHz. Kapasitas membran ngon pipet geukompensasi le rangkaian kompensasi nyang geungui penguat. Mandum percobaan nyan dipeuget di miyup kendali kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), nyang dikendalikan le perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi ngon analisis rutin mandum sel. Segera seugolom rekaman, peunoh pipet ngon larutan dalam nyang na zat-zat lagee nyoe: KCl 4,0 mM, NaCl 2,0 mM, EGTA 0,2 mM, kalium glukonat 135,0 mM, Hepes 10,0 mM (Guphano.TPG5g 4,0 mM) (Na) ngon kreatinin fosfat 10,0 mM geu-adjust ngon pH 7,25, ngon tekanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Langsong lheuh geubri gaya 0 pA keu peureutoh membran, potensi membran istirahat geu uko. Resistensi input geu uko ngon geu peugot arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, ngon -10 pA. Uko rayeuk jih respon tegangan dan pakek hukom Ohm untuk meuhitong resistansi input. Kegiatan spontan geucatat lam klem tegangan seulama 5 minet, dan sPSC geuidentifikasi dan geu uko lam Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Danau Oswego, Oregon, Amerika Serikat) geupakeek skrip pengenalan semi otomatis. Kurva IV ngon arus steady-state geu uko ngon cara geu jeumpa baterai bak potensi nyang beda (mulai dari -110 mV) ngon geu peu ek teugangan lam langkah 5 mV. Produksi AP geu uji ngon geu peugot arus depolarisasi. Jeumpa sel bak -70 mV watee tapeulaku pulsa arus depolarisasi. Sesuaikan ukuran langkah tiep-tiep unit rekaman secara meupisah (10 sampoe 60 pA). Hitong frekuensi AP maksimum deungon cara manual meuhitong spike pulsa nyang jeut keu seubab frekuensi AP paleng manyang. Ambang AP dianalisis deungon geupakeek turunan keudua dari pulsa depolarisasi nyang phon that memicu saboh atawa leubeh AP.
Konfigurasi dan analisis patch nyang meulubang. Peulaku rekaman patch nyang meulubang ngon geungui protokol standar. Pakèk pipet bebas ATP ngon GTP nyang hana bahan-bahan lagèe nyoe: glukonat K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM ngon MgCl2 2 mM, ngon tapeuseusuai ngon pH 7,2 (pakèk KOH). ATP ngon GTP dipeugadeh dari larutan intraseluler untok mencegah permeabilitas membran sel nyang hana terkendali. Pipet tambalan nyan geupeupasoe ngon larutan dalam nyang na amfoterisin (kira-kira 200 sampoe 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) keu meuteumee catatan tambalan nyang meuboh. Amfoterisin geularut lam dimetil sulfoksida (konsentrasi akhe: 0,1 sampoe 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO nyang dipakek hana efek nyang signifikan bak neuron nyang dipeulajari. Lam proses punching, resistensi saluran (Ra) sabe dipantau, dan percobaan dimulai lheuh amplitudo Ra dan AP stabil (20-40 menit). Kegiatan spontan geu uko lam klem tegangan dan/atau arus seulama 2 sampoe 5 minet. Analisis data geupeugot ngon geungui Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, Amerika Serikat), Excel (versi 2010, Perusahaan Microsoft, Redmond, Amerika Serikat) ngon GraphPad Prism (versi 8.1.2, Perangkat Lunak GraphPad Inc. Amerika Serikat). Keu ta teupeu AP nyang spontan, plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro geungui. Identifikasi AP seucara otomatis deungon geupakeek ambang batah nyang ka geubri, nyang geusesuaikan secara individual keu tiep-tiep catatan. Deungon tangui interval lonjakan, tapeuteunte frekuensi lonjakan deungon frekuensi lonjakan instan maksimum dan frekuensi lonjakan rata-rata.
Isolasi PN nyan. Deungon geuadaptasi ngon protokol nyang ka geupeuteubiet seugolom jih, PNs geumurnikan dari cerebellum tikoh bak tahap nyang ka geutentukan (58). Singkat jih, otak kecil dibedah dan dicincang lam media disosiasi nyang lupie lagee es [hana HBSS Ca2+ dan Mg2+, ditambah ngon glukosa 20 mM, penisilin (50 U/ml) dan streptomisin (0,05 mg/ ml)], dan lheuh nyan dicerna · media nyan lam mgSS1-papal1stein. / ml), papain (16 U / ml) dan deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Peulaku seulama 30 minet bak suhu 30°C. Phon-phon that rhah jaringan lam media HBSS nyang na lendir boh telor (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ngon DNase (0,1 mg/ml) bak suhu ruangan untuk mencegah pencernaan enzimatik, lheuh nyan lam media HBSS nyang na glukosa 20 mM), Giling lembut lam HBmilin5. (0,05 mg/ml) ngon DNase (0,1 mg/ml) geupeuleupah sel tunggal. Suspensi sel nyang ka jiteumee nyan jisaring ngon saringan sel 70μm, lheuh nyan sel-sel nyan jipelet ngon cara sentrifugasi (1110 rpm, 5 minet, 4°C) dan jisuspensi lom lam media penyortiran [HBSS, jitambah ngon glukosa 20 mM, 20% stremilin bovine janin) Serum, (0,05 mg/ml)]; evaluasi daya tahan sel ngon propidium iodida dan menyesuaikan kepadatan sel jeut keu 1×106 sampoe 2×106 sel/ml. Sigohlom sitometri aliran, suspensi nyan geusaring rot saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran nyang. Penyortiran sel dipeuget bak suhu 4°C dipakek meusen FACSAria III (BD Biosains) ngen perangkat lunak FACSDiva (BD Biosains, versi 8.0.1). Suspensi sel nyan geupiléh ngon geungui nozzle 100 μm dimiyub teukanan 20 psi ngon laju ~2800 kejadian/detik. Kareuna kriteria gerbang tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, ngon karakteristik hamburan) han jeuet memastikan isolasi PN nyang beutoi dari jeuneh sel laen, strategi gerbang ditetapkan berdasarkan perbandingan langsong intensitas YFP ngon autofluoresensi lam mitoYFP+ ​​ngon kontrol mitoYFP. YFP geu-eksitasi ngon cara geu-iradiasi sampel ngon gareh laser 488 nm, ngon sinyal nyan geu-deteksi ngon geungui filter band pass 530/30 nm. Bak tikoh mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter mitoYFP rosa26 pih geu gunakan keu geu bedakan tuboh neuron ngon fragmen akson. 7-AAD geu-eksitasi ngon laser kuneng 561 nm ngon geudeteksi ngon filter bandpass 675/20 nm keu geupeutubit sel-sel nyang ka mate. Keu peupisah astrosit bak watee nyang saban, suspensi sel geuwarnai ngon ACSA-2-APC, lheuh nyan sampel geuradiasi ngon gareh laser 640 nm, ngon filter bandpass 660/20 nm geupake keu geudeteksi sinyal.
Sel-sel nyang ka jikumpoi nyan ji pelet ngon cara sentrifugasi (1110 rpm, 5 minet, 4°C) dan jikeubah bak suhu -80°C sampoe ji pakek. Tikoh Mfn2cKO ngon aneuk litter jih geu klasifikasikan bak uroe nyang sama untuk meminimalkan variabilitas prosedural. Peunyampaian ngon analisis data FACS geupeugot ngon geungui perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Amerika Serikat).
Lagee nyang disebutkan di ateuh (59), PCR watee nyata dipakek untuk mengisolasi DNA dari neuron nyang diurutkan untuk kuantifikasi mtDNA selanjut jih. Linieritas ngon sensitivitas ambang batah awai jih ji uji ngen ji jalankan qPCR bak jumlah sel nyang beda. Singkat jih, peusapat 300 PN lam penyangga lisis nyang terdiri dari tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% ngon proteinase K (200 ng/ml) dan inkubasi bak suhu 55°C 120 minet. Sel-sel nyan ji inkubasi leubeh lanjot bak suhu 95°C seulama 10 minet untuk ji pastikan inaktivasi lengkap proteinase K. Deungon ji pakek probe TaqMan (Thermo Fisher) nyang spesifik keu mt-Nd1, mtDNA ji uko ngen PCR semi-kuantitatif lam sistem PCR Fific Wate Nyata 7900HT (Ther). Sains, nomor katalog mm04225274_s1), mt-Nd6 (ilmiah termo nelayan, nomor katalog aivi3e8) ngon 18S (ilmiah nelayan termo, nomor katalog hs99999901_s1) gen.
Peusiap sampel proteom. Deungon tapeusuum larutan bak suhu 95°C seulama 10 minet ngon tapeusonik, lam penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida ngon 100 mM tris-HC pelet lam neuron beku]. Bak Bioruptor (Diagenode) seulama 10 minet (masa jeda 30 detik/masa jeda 30 detik). Sampel nyan geu encerkan 1:10 lam tris-HCl 20 mM (pH 8,0), geu campur ngon 300 ng trypsin meuh (Promega), dan geu inkubasi si malam bak suhu 37°C untuk meucapai pencernaan nyang leungkap. Bak uroe keudua, sampel nyan disentrifugasi bak 20.000 g seulama 20 minet. Supernatan nyan diencerkan ngen asam formik 0,1%, dan larutan jih dipeugadeh sira ngen StageTips yang dipeuget keudroe. Sampel nyan geuthoe lam alat SpeedVac (konsentrasi Eppendorf ditambah 5305) bak suhu 45°C, lheuh nyan peptida nyan geususpensi lam asam formik 0,1%. Mandum sampel disiapkan simultan le ureung nyang saban. Untuk geu analisa sampel astrosit, 4 μg peptida nyang hana asin geubri label ngen tag massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Ilmiah) ngen rasio peptida keu reagen TMT 1:20. Untuk pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensi ulang lam 70 μl ACN anhidrat, dan peptida thoe direkonstitusi jeut keu 9 μl 0,1 M TEAB (trietilammonium bikarbonat), dimana 7 μl reagen TMT lam ACN ditamah. Konsentrasi jih nakeuh 43,75%. Lheueh 60 minet inkubasi, reaksi nyan geupeuleumah ngon 2 μl hidroksilamin 5%. Peptida nyang ka geubri label nyan geukumpoi, geuthoe, geususpensi lom lam 200 μl asam formik (FA) 0,1%, geubagi jeut keu dua, lheuh nyan geu peugadeh sira ngon geu pakek StageTips nyang geupeugot keudroe. Deungon geungui kromatograf cair kinerja ultra tinggi UltiMate 3000 (kromatograf cair kinerja ultra tinggi UltiMate 3000), salah saboh dari dua boh bagian nyan geubagi bak kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm nyang geupeuasoe ngon partikel C18 130Å1,7μm (NoWaters, katalog150). Termo Nelayan Ilmiah). Peupisah peptida ngon laju aliran 30μl/min, peupisah dari 1% sampoe 50% penyangga B seulama 85 minet ngon gradien bertahap 96 minet, dari 50% sampoe 95% penyangga B seulama 3 minet, lheuh nyan 8 minet keu 95 % Penyangga B; Penyangga A nakeuh 5% ACN ngon 10 mM amonium bikarbonat (ABC), ngon penyangga B nakeuh 80% ACN ngon 10 mM ABC. Kumpoi peucahan tiep 3 minet dan tapeusaboh jeut keu dua boh kelompok (1 + 17, 2 + 18, dan laen-laen) dan tapeuthoe lam sentrifugal vakum.
Analisis LC-MS/MS nyang geu peugot. Untuk spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) dipisahkan bak kolom analitis PicoFrit diameter dalam 25 cm, 75 μm (lensa objektif baro, nomor bagian PF7508250) yang dilengkapi dengan 1,9 μm ReproSil-Pur C. 1200 (Ilmiah Nelayan Termo, Jerman). Kolom nyan geupeutheun bak suhu 50°C. Penyangga A ngon B nakeuh 0,1% asam formik lam ie ngon 0,1% asam formik lam 80% ACN. Peptida geupisah ngon gradien meulangkah-langkah 200 nl/min dari 6% sampoe 31% penyangga B seulama 65 minet, ngon dari 31% sampoe 50% penyangga B seulama 5 minet. Peptida nyang dielusi dianalisis bak spektrometer massa fusi orbitrap (ilmiah termo fisher). Peu-uko m/z prekursor peptida geupeugot ngon resolusi 120.000 lam kisaran 350 sampoe 1500 m/z. Deungon geungui 27% energi tabrakan nyang ka geunormalisasi, prekursor nyang paleng teuga ngon keuadaan muatan 2 sampoe 6 geupiléh keu pembelahan dissosiasi jeubak C (HCD) energi tinggi. Watèë siklus geu-atô bak 1 s. Nilai m/z fragmen peptida geu uko lam jeubak ion ngon geu pakek target AGC paleng ubit 5×104 ngon watee injeksi maksimum 86 ms. Lheueh fragmentasi, precursor nyan geupeuduek lam daftar pengecualian dinamis seulama 45 s. Peptida nyang geubri label TMT geupisah bak kolom PepMap Acclam 50 cm, 75 μm (ilmiah termo fisher, nomor katalog 164942), ngon spektrum migrasi geuanalisis bak spektrometer massa tribrid lumos orbitrap (spektrometer massa tribrid orbitrap lumos seubagoe ilmiah termo fisher tinggi). (FAIMS) alat (Thermo Fisher Scientific) beroperasi bak dua tegangan kompensasi −50 ngon −70 V. MS3 nyang dipileh berdasarkan prekursor sinkronisasi dipakek untuk pengukuran sinyal ion laporan TMT. Peumisah peptida geupeugot bak EASY-nLC 1200, geungui elusi gradien linier 90%, ngon konsentrasi penyangga 6% sampoe 31%; penyangga A nakeuh 0,1% FA, dan penyangga B nakeuh 0,1% FA dan 80% ACN. Kolom analisis nyan geuoperasi bak suhu 50°C. Pakèk FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Ilmiah) keu neubagi file asli meunurot teugangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi ngon kuantifikasi protein. Deungon geungui meusèn mita Andromeda nyang ka terintegrasi, data asli geuanalisis ngon geungui MaxQuant versi 1.5.2.8. Seulaen urutan rekombinase cre ngon yFP nyang ji peuroleh bak Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida ji mita keu urutan kanonik ngon urutan isoform proteom referensi tikoh (ID proteom UP000000589, ji unduh bak uniProt bak buleun Mei 2010). Oksidasi metionin ngon asetilasi N-terminal protein geu atoe seubagoe modifikasi variabel; metilasi sistein karbamoil geu atoe seubagoe modifikasi teutap. Parameter pencernaan geuset keu “spesifisitas” ngon “tripsin/P”. Jumlah peptida ngon peptida sikin nyang geungui keu identifikasi protein nakeuh 1; jumlah minimum peptida unik adalah 0. Lam kondisi pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein adalah 0,01. Opsi “Peptida Kedua” ka geuaktivasi. Gunakan opsi “cocok antara lari” untuk neupinah identifikasi nyang sukses antara file asli nyang beda. Gunakan rasio minimum LFQ hitongan 1 untuk kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ geu saring setidak jih dua nilai nyang valid lam setidak jih saboh kelompok genotip bak tiep titek watee, ngon geu ekstrapolasi dari distribusi normal ngon luah. 0,3 dan meugrak u miyueb 1,8. Gunakan platform komputasi Perseus dan R untuk menganalisis hasil LFQ. Tes t moderat dua arah dari paket perangkat lunak limma dipakek untuk analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksplorasi geupeugot ngon geungui ggplot, faktoMineR, faktoekstra, GGally ngon pheatmap. Data proteomik berbasis TMT geu analisis ngen geu pakek MaxQuant versi 1.6.10.43. Cari data proteomik mentah dari database proteomik manusia UniProt, nyang ka ji unduh bak buleun September 2018. Analisis nyan mencakup faktor koreksi kemurnian isotop nyang ji sediakan le pabrikan. Gunakan limma dalam R untuk analisis ekspresi diferensial. Data asli, hasee pencarian database, ngon alur kerja analisis data ngon hasee mandum disimpan lam aliansi ProteomeXchange melalui repositori mitra PRIDE ngon pengidentifikasi himpunan data PXD019690.
Anotasi fungsional geupeukaya analisis. Alat Analisis Jalur Kecerdasan (QIAGEN) dipakek untuk menentukan kekayaan istilah anotasi fungsional dari himpunan data bak 8 minggu (Gambar 1). Singkat jih, daftar protein kuantitatif nyang jiteumee dari analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) ji pakek ngon kriteria filter lagee nyoe: Mus musculus ji pileh seubagoe spesies ngon latar, dan kategori nyan ji peutunyok nilai P nyang ji sesuaikan le Benjamini keu pengayaan 0,05 atawa leubeh miyup ji anggap signifikan. Untuk grafik nyoe, limong kategori kelebihan nyang paleng ateuh lam tiep-tiep kluster berdasarkan nilai P nyang disesuaikan ditunjukkan. Deungon geungui uji t nyang le, geungui program dorongan linier dua tahap Benjamini, Krieger, ngon Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein perjalanan watee geupeugot bak kandidat peunteng nyang geuidentifikasi lam tiep-tiep kategori, ngon tiep-tiep bareh geuanalisis secara teupisah. Hana peureulèë ta adopsi SD njang konsisten.
Untuk tapeubandeng hasee penelitian nyoe ngon database nyang ka geupeuteubiet dan tapeuhase diagram Venn lam Gambar 1, kamoe meugabongkan daftar protein kuantitatif ngon anotasi MitoCarta 2.0 (24). Gunakan alat online Gambar Diagram Venn untuk peugot diagram nyan.
Untuk informasi nyang leubeh rinci teuntang prosedur statistik nyang dipakek untuk analisis proteomik, silakan neu rujuk bak bagian nyang sesuai dari Bahan dan Metode. Keu mandum eksperimen laen, informasi nyang rinci jeut ta teume lam lagenda nyang sesuai. Kecuali meunyoe hana dipeugah laen, mandum data dinyatakan seubagoe rata-rata ± SEM, dan mandum analisis statistik dipeuget deungon dipakek perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Keu bahan tambahan keu artikel nyoe, neukalön bak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/35/6/eaba8271/DC1.
Nyoë nakeuh saboh artikel akses teubuka nyang geusebarkan dimiyub syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, nyang meumungkén keu geungui, geusebarkan ngon geupeureproduksi lam media peu mantong, asai geungui akhé kon keu keuntongan komersial ngon premis jih nakeuh bahwa karya asli nyan beutôi. Rujokan.
Catatan: Kamoe hanya meulakee droeneuh neubri alamat email droeneuh supaya ureung nyang droeneuh rekomendasikan keu laman nyan jiteupeu bahwa droeneuh neumeuheut awak nyan kalon email nyan dan bahwa email nyan kon spam. Kamoe hana akan meureukam alamat email sapeu.
Soalan nyoe geungui keu geutes peuë droëneuh nakeuh ureuëng tamong ngon geucegah otomatis neukirém spam.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisko, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron nyang hana berfungsi meungkapkan bahwa program metabolisme diaktifkan keu meulawan neurodegenerasi.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisko, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron nyang hana berfungsi meungkapkan bahwa program metabolisme diaktifkan keu meulawan neurodegenerasi.
©2020 Asosiasi Amerika keu Kemajuan Sains. mandum hak geukeubah. AAAS nakeuh mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kemajuan Sains ISSN 2375-2548.