Saat nyoe†Alamat jinoe: OX11 0DE, Inggréh, Geudong Intan, Taman Sains ngon Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggréh, Sumber Cahaya Intan Co., Ltd., Pusat Pencitraan Biologis Elektronik.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) nyan komponen fotosintesis inti bakteri fototrofik ungu. Kamoe meupeuturi dua boh struktur mikroskopi krio-elektron dari kompleks RC-LH1 dari Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2,65-Å dari kompleks RC-LH114-W terdiri dari 14 loop subunit LH1 nyang mengelilingi RC, nyang terganggu uleh protein W, sedangkan kompleks nyang hana protein-W sepenuh jih komposisi RC nyang dikelilingi uleh RC. Ditop 16 subunit LH1 loop. Perbandingan struktur nyoe geubri wawasan teuntang dinamika kinon lam kompleks RC-LH1, termasok perubahan konformasi nyang seugolom jih hana ditentukan watee meuikat kinon bak situs RC QB, seureuta lokasi situs pengikatan kinon tambahan nyang membantu Pass awaknyan keu RC. Struktur unik protein W mencegah penutupan loop LH1, sehingga menciptakan saluran untuk mempercepat pertukaran kinon/kinolon.
Energi nyang ji sediakan le fotosintesis jeut ji peutheun karap mandum kehidupan di bumoe, ngon na potensi rayeuk keu bioteknologi surya. Watee geu promosi fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu pih geu peutunyok berbagai mode energi ngen kemampuan metabolisme. Awaknyan jeut geuhindari fotosintesis ngon timoh seubagoe bakteri heterotrofik lam seupot, jeut geupeugot nitrogen ngon karbon dioksida, geupeuhase hidrogen, ngon geupeudegradasi senyawa aromatik (1-3). Keu peuseudia energi keu proses-proses nyan, cahya harôih bagah ngon efisien geuubah jeuet keu energi kimia. Proses nyoe dimulai watee kompleks antena nyang jijeubak cahaya jiserap cahaya dan jipinah energi nyang jijeubak u pusat reaksi (RC), sampoe jimula pemisahan muatan (4 – 7). Unit dasar fotosintesis bak bakteri fototrofik ungu terdiri dari tipe 2 RC, dikelilingi oleh kompleks panen cahaya 1 (LH1), membentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 geubentuk oleh rangkaian heterodimer αβ nyang melengkung, nyang maseng-maseng meuikat dua molekul klorofil bakteri (BChl) ngon saboh atawa dua karotenoid (8-12). Antena LH1 nyang paleng sederhana terdiri dari 16 atawa 17 heterodimer αβ nyang mengelilingi RC (9-13) lam loop nyang teutop, tapi lam kompleks inti laen, peptida transmembran mengganggu kelanjutan LH1 nyang mengelilingi, Deungon demikian mempromosikan difusi kinol/kinon ngon sitok1, antara bRC1. 13-15). Bungong fototrofik warna ungu Rhodopseudomonas (Rps.) nyan saboh organisme model yang jeut geu pahami transfer energi ngen elektron yang geudukong fotosintesis Struktur kristal phon Rps. Model kompleks RC-LH1 palustris nakeuh RC, dikelilingi oleh 15 loop LH1 heterodimer, nyang diganggu oleh protein nyang hana dituri nyang disebut “Protein W” (14). Protein-W kemudian diidentifikasi seubagoe RPA4402, nyang merupakan protein 10,5kDa nyang hana berciri deungon lhee heliks transmembran (TMH) nyang diprediksi. Kamoe mengusulkan untuk geugantoe nan gen rpa4402 nyang menyandikan protein W jeut keu pufW supaya konsisten ngen nomenklatur nyang geu pake keu gen nyang menyandikan subunit RC-L, M (pufL, pufM) ngon LH1α, β (pufA, pufB). Nyang menarik, protein-W hanya na lam sekitar 10% dari RC-LH1, mengungkapkan Rps. palustris geupeuhasé dua boh kompleks RC-LH1 nyang meulaén. Di sinoe, kamoe meulaporkan struktur krio-EM (krio-EM) resolusi tinggi dari dua kompleks inti, saboh deungon protein W ngon 14 heterodimer αβ, nyang laen hana protein W ngon loop LH1 16 Heterodimer nyang teutop. Struktur kamoe mewakili saboh perubahan langkah lam pemahaman kompleks RC-LH1 dari Rps. palustris, karena kamoe ka menganalisis populasi homogen dari tiep-tiep varian dan na resolusi yang cukop untuk jeulah menetapkan tiep-tiep peptida dan pigmen yang terikat dan lipid dan kinon yang terkait. Perbandingan struktur nyoe menunjukkan bahwa lhee protein TMH-W nyang hana diteumee lam kompleks RC-LH1 laen seulama nyoe menghasilkan saluran kinon untuk mempercepat pertukaran kinon/kinolon. Sejumlah situs pengikat lipid ngon kinon nyang dikonservasi kaleuh diidentifikasi, ngon kamoe ka mengungkapkan perubahan konformasi baroe lheuh kombinasi kinon ngon RC, nyang mungken cocok keu fotosistem II (PSII) RC dari organisme fototrofik nyang beroksigen. Temuan kamoe geubri wawasan baroe keu kinetika pengikatan ngon pertukaran kinon/kinolon lam kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Supaya memudahkan kajian detail teuntang dua kompleks nyang diteumee di Rps. palustris, kamoe meuisolasi tiep-tiep RC-LH1 ngon cara biokimia. Kompleks defisiensi protein W (selanjut jih disebut sebagai ΔpufW) dimurnikan dari strain yang hana gen pufW (16), dan hanya saboh kompleks RC-LH1 yang jeut diproduksi. Kompleks nyang mengandung protein W geu produksi oleh saboh strain. Protein W dari strain nyoe ji modifikasi ngen tag His 10x bak C-terminus jih, sehingga kompleks nyang mengandung protein W jeut secara efektif ji gabungkan ngen protein W nyang paleng kureung ngen ji imobilisasi logam. Kompleks nyan geupisah deungon efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Lagee nyang deuh bak Gambar 1, bandua kompleks nyan na lhee boh sub-unit RC (RC-L, RC-M dan RC-H) nyang dikeulileng le antena LH1. Struktur 2,80-A dari kompleks nyang hana protein-W menunjukkan 16 heterodimer αβ, membentuk loop LH1 nyang teututop nyang sepenuh jih mengelilingi RC, selanjut jih disebut seubagoe kompleks RC-LH116. Struktur 2,65Å dari kompleks nyang mengandung protein-W na 14-heterodimer LH1 nyang diganggu uleh protein-W, selanjut jih disebut seubagoe RC-LH114-W.
(A dan B) Representasi permukaan senyawa. (C dan D) Pigmen nyang meuikat nyang dinyatakan lam batang. (E ngon F) Kompleks nyang diamati dari permukaan sitoplasma na peptida ngon subunit LH1 nyang diwakili lam kartun, ngon geubri nomor searah jeum dari celah protein-W [konsisten ngon penomoran Rba. kompleks sferoid (13)]. Keu LH1-α, warna subunit protein nakeuh kuneng; keu LH1-β, wareuna subunit protein nakeuh biru; keu protein-W, protein nyan mirah; keu RC-H, nyan cyan; keu RC-L, nakeuh Oranye; keu RC-M, warna puteh. Kofaktor diwakili uleh batang, warna ijo mewakili molekul BChl ngon BPh a, ungu mewakili karotenoid, ngon warna kuneng mewakili molekul UQ10. (G dan H) Pandangan yang diperbesar dari celah protein-W di wilayah yang setara kompleks RC-LH114-W (G) dan kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor geupeuleumah lam bentuk peunoh ruang, kuin kelat geupeuleumah lam warna biru. Celah protein-W disorot le gareh putus-putus biru bak (G), dan lubang-lubang ubeut dipat quinone/quinolol menyebar bak encin LH116 disorot le gareh putus-putus itam bak (H).
Gambar 1 (A dan B) menunjukkan RC yang dikelilingi oleh array heterodimer LH1αβ yang terbuka atau tertutup, yang maseng-maseng mengikat dua BChl dan saboh karotenoid (Gambar 1, C dan D). Penelitian seugolom jih ka geupeuleumah bahwa Rps nakeuh kompleks LH1. Lam jalur biosintesis xantin spirulina, spesies nyoe na populasi karotenoid nyang meujampu (17). Namun, spiropirroksantin nakeuh karotenoid nyang dominan ngon kepadatan jih memuaskan. Kareuna nyan, kamoe memilih untuk memodelkan spiroxanthin bak mandum situs pengikat LH1. Polipeptida alfa ngon beta nakeuh TMH tunggal ngon daerah luwa membran paneuk (Gambar 1, A, B, E, ngon F). Meskipun kepadatan 17 residu bak C-terminus hana diamati, polipeptida alfa dipeuhah dari Met1 keu Ala46 bak kedua kompleks nyan. Polipeptida β geu peukureung dari Gly4 jeut keu Tyr52 bak RC-LH116, dan dari Ser5 jeut keu Tyr52 bak RC-LH114-W. Hana kepadatan 3 atawa 4 residu N-terminal atawa 13 residu C-terminal nyang diamati (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks RC-LH1 campuran nyang disiapkan dari strain tipe liar geupeuleumah bahwa daerah nyang gadeh nyan nakeuh hase dari pembelahan heterolog peptida nyoe (Gambar S1 ngon S2). Formilasi N-terminal α-Met1 pih geuamati (f). Analisis nyan geupeuleumah bahwa α-peptida nyan terdiri dari residu fMet1 sampoe Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, dan β-peptida nyan terdiri dari residu Ser2 sampoe Ala53, nyang seusuai that ngon peta kepadatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 ngon β-His36 geupeugot BChls meuhadap muka; tiep-tiep heterodimer αβ meuraket ngon tetangga jih keu membentuk loop teubuka (RC-LH114-W) atawa loop teutop (RC-LH116) di sekitar RC Array pigmen nyang meugabong eksiton (Gambar 1, C ngon D). Dibandingkan ngon pita 877 nm RC-LH114-W, pergeseran mirah serapan 880 nm RC-LH116 nakeuh 3 nm (Gambar 2A). Namun, spektrum dikroisme meulingka karap saban (Gambar 2B), nyan menunjukkan bahwa meskipun na perbedaan nyang jeulaih antara loop teubuka ngon teutop, lingkungan lokal BChls that saban. Pergeseran mirah absorpsi mungken hase dari gerak termal nyang meukureng ngon stabilitas nyang meutamah bak loop teutop (18, 19), perubahan kopling pigmen nyang diseubabkan le loop teutop (20, 21), atawa kombinasi dari dua efek nyoe (11).
(A) Spektrum absorpsi ultraviolet/ deuh/inframerah toe, puncak-puncak jih geutanda ngon pigmen nyang sesuai dan geunormalisasi keu puncak BPh bak 775 nm. (B) Spektrum dikroisme meulingka nyang dinormalisasi keu absorbansi BChl bak 805 nm. (C dan D) Spektrum ΔA nyang dipileh dari spektrum absorpsi nyang dipeuselesaikan watee kompleks RC-LH114-W (C) dan kompleks RC-LH116 (D). Untuk perbandingan yeng lubeh get, mandum spektrum dinormalisasi keu ∆A dari −A bak 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 lheuh iradiasi deungon na berbagai konsentrasi UQ2 (kalon Gambar S8 untuk data mentah). (F) Lam sel-sel nyang timoh di miyup cahaya intensitas miyub, menengah atawa tinggi (maseng-maseng 10, 30 atawa 300μMm-2 s-1), subunit protein W ngon RC-L lam kompleks nyang ka geumurnikan ngon rasio membran nyang ka geupisah. Tentukan tingkat protein ngen elektroforesis gel SDS-poliakrilamida ngon imunoassay (eu Gambar S9 keu data mentah). Neupeuteunte rasio relatif ngon kompleks RC-LH114-W nyang ka geumurnikan. Rasio stoikiometri RC-L ngon protein-W dari kompleks nyan nakeuh 1:1.
BChls bak posisi 1 lam loop αβ14 nyang ka cacat RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, dan E) leubeh toe ngon donor primer RC (P) 6,8Å nibak BChls nyang setara bak RC-LH116 (Gambar. 1, B, D); namun, kinetika absorpsi transien dari dua kompleks nyan menunjukkan bahwa untuk RC-LH114-W dan RC-LH116, konstanta watee transfer energi eksitasi dari LH1 keu RC nakeuh 40 ±4 dan 44±3 ps (Gambar 2). , C dan D, Gambar S4 dan Tabel S2). Hana cit perbedaan nyang signifikan lam transfer elektronik lam RC (Gambar S5 dan teks tambahan nyang terkait). Kamoe curiga bahwa korespondensi nyang toe watee transfer energi antara LH1 ngon RC-P diseubabkan le jarak, sudut ngon energi potensial nyang saban dari sebagian rayeuk BChl lam dua boh loop LH1. Nampak jih eksplorasi pola energi LH1 untuk troh jarak minimum hana leubeh bagah dari transfer energi langsong dari situs suboptimal keu RC. Loop LH1 loop teubuka lam RC-LH114-W mungken cit mengalami gerak termal nyang hana signifikan lam kondisi suhu miyub untok analisis struktural, ngon na konformasi encin αβ14 nyang leubeh panyang bak suhu ruangan dari jarak pigmentasi βBChls bak posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 na 32 BChls ngon 16 karotenoid, ngon susunan keseluruhan jih saban ngon nyang jiteumee dari pidpidum Thermochromatium (Tch.) (12) dan ganggang ijo (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Lheueh peularas, hanya penyimpangan ubeut bak posisi heterodimer αβ nyang diamati, terutama 1-5, 15, ngon 16 (Gambar S6). Kehadiran protein-W na dampak nyang signifikan bak struktur LH1. Lhee boh TMH jih geuhubongkan le loop paneuk, ngon terminal N bak sisi lumen kompleks ngon terminal C bak sisi sitoplasma (Gambar 1A ngon 3, A sampoe D). Protein-W sebagian rayeuk hidrofobik (Gambar 3B), ngon TMH2 ngon TMH3 berinteraksi ngon LH1αβ-14 untok membentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B ngon E sampoe G). Antarmuka jih terutama terdiri dari residu Phe, Leu ngon Val di wilayah transmembran. Residu nyoe geutumpôk ngon asam amino hidrofobik ngon pigmen αβ-14. Meupadum residu polar cit berkontribusi bak interaksi, teumasok ikatan hidrogen antara W-Thr68 ngon β-Trp42 bak permukaan rongga kompleks (Gambar 3, F ngon G). Bak permukaan sitoplasma, Gln34 berdekatan ngon kelompok keto karotenoid αβ-14. Seulaen nyan, molekul n-dodesil β-d-maltosida (β-DDM) dipeuleuh, ngon iku hidrofobik jih meuluah u antar muka antara protein-W ngon αβ-14, ngon iku lipid mungken na lam tuboh. Kamoe pih meupeurati bahwa daerah resolusi C-terminal protein W ngon RCH that toe, tapi hana lam lingkup pembentukan interaksi spesifik (Gambar 1, A ngon E). Namun, mungken na interaksi lam asam amino C-terminal nyang hana terpecahkan dari dua protein nyoe, nyang mungken menyediakan mekanisme untok perekrutan protein-W seulama perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, nyang meuhadap antarmuka ngon LH1αβ14 lam bentuk kartun, na rante samping meubentuk batang (mirah), nyang geupeuleumah bak saboh bagian diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan ngon tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W nyang diwakili le permukaan nyang meuwarna hidrofobik. Area kutub ngon bermuatan dipeudeuh lam warna cyan, daerah hidrofobik dipeudeuh lam warna puteh, ngon daerah hidrofobik nyang teuga dipeudeuh lam warna oren. (C ngon D) Protein-W nyang geuwakili lam kartun, orientasi jih saban ngon lam (A) (C), ngon geuputa 180° (D). Meunurot posisi lam urutan, residu nyang jeuet dibedakan geuadopsi skema warna pelangi, di pat terminal N warna biru ngon terminal C warna mirah. (E) Protein-W lam pandangan nyang saban ngon lam (A), ngon residu bak antarmuka protein-W:LH1 diwakili le batang ngon tanda nyang meuleukat. (F) Protein-W diputar 90° relatif teuhadap (E) ngon LH1αβ14 lam representasi kartun, ngon relatif teuhadap residu antarmuka lam representasi batang. Residu nyang meugantung bak polipeptida beta geubri label. Kofaktor geupeuleumah seubagoe bar nyang cocok ngon warna Gambar 1, β-DDM nyang ka terurai geupeuleumah ngon warna abu-abu, ngon oksigen geupeuleumah ngon warna mirah. (G) Pandangan lam (F) diputar 180°, deungon residu nyang menonjol dari polipeptida alfa nyang dibri label.
Protein-W menggantoe heterodimer αβ (keu-15 lam Gambar 1F), sampoe mencegah penutupan loop ngon memiringkan lhee heterodimer αβ phon. Dikalon bahwa sudot kemiringan maksimum heterodimer αβ-1 phon relatif terhadap normal pilem nakeuh 25° sampoe 29° (Gambar 1, A dan E), nyang dibentuk le kemiringan 2° sampoe 8° αβ-1 di RC A kontras tajam-LH116 dan F (Gambar 1, B). Heterodimer keudua ngen keu lhee maseng-maseng miring bak 12° sampoe 22° ngen 5° sampoe 10°. Kareuna hambatan sterik RC, kemiringan αβ-1 hana mencakup pasangan kedua αβ (nyang sesuai deungon αβ ke-16 lam Gambar 1F), sehingga membentuk celah nyang jeulah lam encin LH1 (Gambar 1, A dan E) . Kareuna kureung jih dua heterodimer αβ, disertai deungon gadeh jih peut BChl ngon dua karotenoid, hana saboh pih karotenoid nyang meuikat bak subunit αβ-1 nyang meulinteung, nyang menghasilkan encin LH114-W nyang mengandung 13 karotenoid Vegetarian ngon 28 BChls. Perkiraan resolusi lokal dari dua kompleks di wilayah αβ1 sampoe 7 leubeh miyub dari pada loop LH1 nyang laen, nyang mungken mencerminkan plastisitas nyang meulekat bak subunit LH1 nyang berdekatan ngon situs RC QB (Gambar 4).
Gambar RC-LH114-W (A dan B) dan RC-LH116 (C dan D) ditunjukkan dari pandangan ateuh/pandangan samping (A dan B) (A dan C) dan permukaan rongga yang sama dari Gambar 1. (B dan D). Kunci-kunci nyang meuwarna nyan geupeuleumah bak blah uneun.
Saboh-saboh jih kompleks inti nyang khas laen ngon rasio stoikiometri 1:14 nakeuh dimer RC-LH1-PufX (13). Namun, protein W ngon PufX hana homologi nyang jeulah, ngon na dampak nyang signifikan bak struktur LH1 maseng-maseng. PufX nakeuh saboh TMH ngon domain sitoplasma N-terminal nyang berinteraksi ngon sisi sitoplasma subunit RC-H (13) bak posisi nyang sesuai ngon Rps. bak lh116αβ-16. PufX jipeugot saluran keu pertukaran kinon/kinolon antara RC-LH1 ngon kompleks sitokrom bcl ngon na lam mandum Rba. kompleks inti sferoid (13). Meskipun antarmuka monomer-monomer na di Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX na bak posisi meuikat protein W lam RC-LH114-W, ngon celah nyang dipicu le PufX ngon protein-W na bak posisi nyang setara (Gambar S7A). Kesenjangan bak RC-LH114-W pih sejajar ngon saluran kinon hipotetis (8) dari Pseudomonas rosea LH1, nyang dibentuk le peptida nyang hana berhubungan ngon protein W atawa PufX (Gambar S7B). Seulaén nibak nyan, saluran kuin di Blc. LH1 ijo zamrud nyang teubeuntuk deungon cara geupeugadeh saboh subunit γ (7) na bak posisi nyang saban (Gambar S7C). Meskipun dimediasi oleh protein nyang berbeda, muncul jih saluran kinon/kinolol nyoe bak posisi nyang sama lam kompleks RC-LH1 deuh jih jeut keu contoh evolusi konvergen, nyang menunjukkan bahwa celah nyang diciptakan oleh protein W jeut bertindak seubagoe saluran kinon.
Celah lam loop LH114-W memungkenkan pembentukan wilayah membran nyang sabe antara ruang internal kompleks RC-LH114-W ngon membran massal (Gambar 1G), dibandeng menghubungkan duwa domain melalui pori protein lagee lam protein. Kompleks RC-LH116 nyoe saban ngon Tch nyang teutop. Kompleks lagee jarom (22) (Gambar 1H). Kareuna difusi kinon melalui membran leubeh bagah dibandeng difusi melalui saluran protein nyang sempit, loop LH114-W nyang teubuka jeuet memungkenkan perputaran RC nyang leubeh bagah dibandeng loop LH116 nyang teutop, ngon difusi kinon u dalam RC mungken leubeh teubatah. Untuk geutes peu protein W nyan mempengaruhi konversi kinon melalui RC, kamoe meulakukan assay oksidasi sitokrom bak konsentrasi tertentu ubikinon 2 (UQ2) (analog UQ10 alami deungon iku isopren nyang leubeh paneuk) (Gambar 2E). Meskipun na jih kinon kelat menghambat penentuan akurat konstanta Michaelis nyang jeulaih (RC-LH114-W ngon RC-LH116 cocok keu 0,2±0,1μM ngon 0,5±0,2μM, maseng-maseng), tingkat maksimum RC-LH1,4-6-1 nakeuh RC-LH114-1. 28±5% leubeh rayeuk nibak RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Kamoe awai meukira bahwa protein-W na lam kira-kira 10% dari kompleks inti (16); di sinoe, tingkat penghunian sel pertumbuhan cahaya rendah, cahaya menengah, dan cahaya tinggi nakeuh 15±0,6%, 11±1% dan 0,9±0,5, maseng-maseng % (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa geupeuleumah bahwa penambahan tag histidin hana geupeukureung kelimpahan relatif protein-W dibandengkan ngon strain tipe liar (P = 0,59), sehingga tingkat nyoe kon artefak protein-W nyang dimodifikasi (Gambar S10). Namun, pendudukan protein-W nyang miyub nyoe lam kompleks RC-LH1 mungken memungkenkan padum-padum boh RC untuk membalikkan bak tingkat nyang dipercepat, sampoe mengurangi pertukaran kinon/kinolon nyang leubeh lambat lam kompleks RC-LH116. Kamoe meupeurati bahwa tingkat penghunian cahaya nyang tinggi hana konsisten ngon data transkriptomik baroe-baroe nyoe, nyang menunjukkan bahwa ekspresi gen pufW meningkat di miyup cahaya nyang teuga (Gambar S11) (23). Perbedaan antara transkripsi pufW ngon penggabungan protein-W lam kompleks RC-LH1 nyan membingungkan ngon mungken mencerminkan regulasi kompleks protein.
Lam RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) ngon 29 molekul β-DDM dialokasikan ngon dimodelkan lam jih 6 CDL, 24 POPC, 2 POPGβDM ngon 12. RC-LH116 (Gambar 5, A dan B). Lam dua boh struktur nyoe, CDL karap na bak sisi sitoplasma kompleks, sedangkan POPC, POPG ngon β-DDM sebagian rayeuk na bak sisi luminal. Dua molekul lipid ngon deterjen geuisolasi bak wilayah αβ-1 sampoe αβ-6 kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), ngon limong geuisolasi bak wilayah setara RC-LH116 (Gambar 5B ). Leubeh le lipid nyang diteumee di sisi laen kompleks, terutama CDL, nyang meutamah antara RC ngon αβ-7 sampoe αβ-13 (Gambar 5, A ngon B). Lipid ngon deterjen laen nyang terselesaikan seucara struktural na di luwa encin LH1, ngon rantai asil nyang terselesaikan deungon get membentang antara subunit LH1, seucara sementara ditunjukkan seubagoe β-DDM lam RC-LH114-W, ngon didefinisikan seubagoe β-DDM lam RC A campuran βPOPC-DHDM ngon βPOPC166. Posisi nyang saban dari lipid chelating ngon deterjen lam struktur geutanyoe menunjukkan bahwa awaknyan nakeuh situs pengikatan nyang relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul nyang setara lam Tch cit na konsistensi nyang get. Lembut dan Trv. Strain 970 RC-LH1s (Gambar S12, B sampoe E) (9, 12) ngon residu ikatan hidrogen dari kelompok ulee lipid menunjukkan konservasi nyang cukop get lam penyelarasan urutan (Gambar S13), menunjukkan bahwa CDL Konservasi nyang meuikat bak RC (24), situs-situs nyoe mungken di komp.
(A dan B) Peptida RC-LH114-W (A) dan RC-LH116 (B) diwakili le kartun, dan pigmen diwakili le batang, dipakek skema warna lam Gambar 1. Lipid ditunjukkan deungon warna mirah, dan deterjen digambarkan deungon warna abu-abu. UQ nyang meuikat bak situs RC QA ngon QB warna jih kuneng, seudangkan UQ nyang terisolasi warna jih biru. (C dan D) Pandangan nyang saban ngon (A) dan (B), deungon lipid nyang geupeugadeh. (E sampoe G) Pandangan nyang geupeurayeuk nibak Q1(E), Q2(F) ngon Q3(G) dari RC-LH116, ngon rante samping nyang saleng meupengaroh. Ikatan hidrogen dipeudeuh seubagoe gareh putus-putus itam.
Lam RC-LH116, RC QA ngon QB UQ, nyang ikot transfer elektron lam proses peumisah muatan, terurai bak teumpat meuikat jih. Namun, bak RC-LH114-W, QB quinone gohlom dipeuseuleusoe dan akan dibahas secara rinci di miyup nyoe. Seulaen quinone QA ngon QB, dua boh molekul UQ chelat (nyang na di antara encin RC ngon LH1) geubagi lam struktur RC-LH114-W meunurot kelompok ulee awaknyan nyang ka geupeuleuh deungon get (nyang na di Q1 ngon Q2, maseng-maseng). pansa). Gambar 5C). Dua unit isoprene diteutapkan keu Q1, ngen peta kepadatan menyelesaikan 10 ekor isopren leungkap dari Q2. Lam struktur RC-LH116, lhee molekul UQ10 chelat (Q1 sampoe Q3, Gambar 5D) ka geupeuleuh, dan mandum molekul na kepadatan nyang jeulaih bak mandum iku (Gambar 5, D sampoe G). Lam dua boh struktur nyan, posisi kelompok ulee kuin Q1 ngon Q2 na konsistensi nyang that get (Gambar S12F), ngon awaknyan hanya berinteraksi ngon RC. Q1 na bak pintô tamong celah W RC-LH114-W (Gambar 1G dan 5, C, D dan E), dan Q2 na bak teumpat meuikat QB (Gambar 5, C, D) dan F). Residu L-Trp143 ngon L-Trp269 nyang ka geukonservasi that toe ngon Q1 ngon Q2 ngon geubri potensi interaksi π-stacking (Gambar 5, E ngon F, ngon Gambar S12). L-Gln88, 3,0 Å nibak oksigen distal Q1, geubri ikatan hidrogen nyang teuga (Gambar 5E); residu nyoe geukonservasi bak mandum RC kecuali hubungan nyang paleng jioh (Gambar S13). L-Ser91 seucara konservatif geugantoe Thr bak sebagian rayeuk RC laen jih (Gambar S13), nakeuh 3,8 Angstrom dari metil oksigen Q1, ngon jeuet geubri ikatan hidrogen nyang leumoh (Gambar 5E). Q3 deuh jih hana interaksi nyang spesifik, tapi na di daerah hidrofobik antara subunit RC-M ngon subunit LH1-α 5 sampoe 6 (Gambar 5, D ngon G). Q1, Q2 ngon Q3 atawa kinon kelat nyang toe pih ka geupeuleuh lam Tch. Lembut, Trv. Galur 970 ngon Blc. Struktur iris (9, 10, 12) menunjukkan bak situs pengikatan kinon tambahan nyang dikonservasi lam kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Limong UQ nyang ka teurarai lam RC-LH116 nyan seusuai that ngon 5,8±0,7 dari tiep-tiep kompleks nyang ditentukan le kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), seudangkan lhee UQ nyang ka teurarai lam RC-LH114-W leubeh miyub nibak Nilai nyang diuko dari 6,2±0,3 molecules are)4. struktur.
Polipeptida L ngon M pseudo-simetris maseng-maseng mengandung limong TMH ngon membentuk heterodimer nyang menggabongkan saboh dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), ngon saboh beusoe non-Heme ngon saboh atawa dua molekul UQ10. Meulalui na ikatan hidrogen bak kelompok keton terminal ngon akumulasi nyang dituri lam Rps, karotenoid nyang dipeutamong lam subunit M nyang diboh nan cis-3,4-dehidroorhodopin. Jeunèh (25) boh. Domain membran lua RC-H dipeukong bak membran le saboh TMH. Struktur RC secara keseluruhan saban ngon lhee subunit RC spesies nyang terkait (lagee Rba). sferoid (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl ngon BPh, tulang punggong karotenoid ngon beusoe non-heme tumpang tindeh lam rentang resolusi struktur nyoe, lagee kelompok ulee UQ10 bak situs QA ngon kinon QB bak RC-LH116 (Gambar S15).
Ketersediaan dua struktur RC deungon tingkat penghunian situs QB nyang berbeda geubri kesempatan baroe untuk geupareksa perubahan konformasi nyang konsisten nyang menyertai ikatan quinone QB. Lam kompleks RC-LH116, kinon QB na bak posisi “proksimal” nyang meuikat sepenuh jih (26), tapi pemisahan RC-LH114-W hana kinon QB. Hana QB kinon lam RC-LH114-W, nyang hireuen sabab kompleks nyan aktif, leubeh nibak kompleks RC-LH116 ngon kinon QB nyang ka teupeuleuh seucara struktural. Meskipun dua encin LH1 mengelat sekitar nam kinon, limong secara struktural dipeuselesaikan lam encin RC-LH116 nyang teutop, seudangkan hanya lhee nyang secara struktural teubatah lam encin RC-LH114-W nyang teubuka. Peningkatan gangguan struktural nyoe mungken mencerminkan penggantian situs QB RC-LH114-W nyang leubeh bagah, kinetika kinon nyang leubeh bagah lam kompleks, ngon peningkatan kemungkenan untuk meulintas loop LH1. Kamoe meusarankan bahwa kureung UQ di situs RC QB RC-LH114-W mungken akibat dari kompleks nyang leubeh kompleks dan leubeh aktif, dan situs QB RC-LH114-W ka langsong beku lam perputaran UQ Tahap spesifik (pintu tamong u situs QB nyoe ka ditutop konformasi ref.
Meunyo hana QB, rotasi nyang menyertai L-Phe217 keu posisi nyang hana sesuai ngon ikatan UQ10, kareuna akan menyebabkan tabrakan spasial ngon unit isoprene phon nibak ikue (Gambar 6A). Seulaen nyan, perubahan konformasi utama nyang jeulaih jeulaih, terutama heliks de (heliks paneuk lam loop antara TMH D ngon E) dipat L-Phe217 geugantoe u kantong pengikat QB ngon rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A ) Untuk meupeugah ikatan hidrogen entrase ngon M- teumpat (Gambar 6B). Heliks de pivot bak dasar jih, Cα dari L-Ser209 meugese 0,33Å, seudangkan L-Val221Cα meugese 3,52Å. Hana na perubahan nyang jeuet ta amati bak TMH D ngon E, nyang jeuet ta superimpos lam bandua struktur nyan (Gambar 6A). Seujauh nyang ka ta teupeu, nyoe keuh struktur phon lam RC alam nyang jitop situs QB. Peubandeng deungon struktur nyang leungkap (QB-bound) menunjokkan bahawa sigohlom kinon dipeukureng, perubahan konformasi dipeureulee untok peuget jih tamong lam kinon. L-Phe217 berputar untok membentok interaksi π-stacking deungon kelompok ulee quinone, ngon heliks bergeser keu luwa, memungkenkan rangka L-Gly222 ngon rante samping L-Tyr223 untok membentok jaringan ikatan hidrogen deungon struktur ikatan hidrogen nyang stabil (Gambar 6, A ngon C).
(A) Kartun tumpang tindeh hologram (rantai L, rantai oren/M, magenta) ngon struktur apo (abu-abu), dipat residu kunci geupeuleumah lam bentuk representasi lagee batang. UQ10 geuwakilé lé saboh bar nyang wareunajih kunèng. Gareh puteh-puteh nyan menunjokkan ikatan hidrogen nyang terbentok lam mandum struktur. (B dan C) Representasi permukaan apolipoprotein dan seluruh struktur encin, menyorot oksigen rante samping L-Phe217 dalam warna biru dan L-Tyr223 dalam warna mirah, maseng-maseng. Subunit L nyan warna jih oren; subunit M ngon H hana meuwarna. (D dan E) Situs QB RC apolipoprotein (D) dan seluruh (E) [warna oleh (A) maseng-maseng] dan Termofilus termofil PSII (hijo, biru dengan kinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajarkan (58).
Hana teuduga, meskipun na padum-padum boh struktur RC nyang defisiensi QB hana LH1, perubahan konformasi nyang diamati lam penelitian nyoe hana dilaporkan seugolom jih. Nyan pih jitamong lam struktur depletion QB dari Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) dan Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), mandum nyan karab saban ngon struktur QB awaknyan mandum. Inspeksi nyang toe bak 3PRC meungkap bahwa molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) meuikat bak pinto tamong posisi QB, nyang jeuet mencegah penataan ulang jeut keu konformasi nyang teutop. Meskipun LDAO hana meu-ulang bak posisi nyang saban lam 1EYS atawa 1OGV, RC-RC nyoe disiapkan ngon dipakek deterjen nyang saban ngon kareuna nyan mungken jipeuhase efek nyang saban. Struktur kristal Rba nyan. Sphaeroides RC nyang meukristal bersama ngon sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) pih deuh jih na situs QB nyang teutop. Namun, lam hai nyoe, wilayah N-terminal dari polipeptida RC-M (berinteraksi deungon situs mengikat QB melalui ikatan H dari residu Tyr bak heliks Q) mengadopsi konformasi nyang hana alami, ngon perubahan konformasi QB hana dieksplorasi leubeh lanjot (30). Nyang jeut keu teunang nakeuh geutanyoe hana takalon deformasi polipeptida M lagee nyoe lam struktur RC-LH114-W, nyang karap saban ngon wilayah N-terminal RC-LH116 RC. Perlu cit diperhatikan bahwa lheuh geuhapus antena LH1 berbasis deterjen, RC apolipoprotein lam PDB ka geupeuleuh, nyang geupeugadeh kolam kinon internal ngon lipid lam celah antara RC ngon permukaan dalam encin LH1 nyang na di sekitar jih (31, 32). RC teutap fungsional kareuna geupeutheun mandum kofaktor, kecuali QB quinone nyang jeuet diuraikan, nyang kureung stabil ngon kayém gadôh lam proses peusiapan (33). Seulaen nyan, dituri bahwa peugadeh LH1 ngon lipid siklik alami dari RC jeuet na dampak bak fungsi, lagee peusingkat masa udep P+QB-state nyang dipisahkan muatan (31, 34, 35). Kareuna nyan, kamoe meuspekulasi bahwa na lingkaran LH1 lokal nyang meulingka RC mungken geupeutheun situs QB nyang “teutop”, deungon lagee nyan geupeutheun lingkungan lokal nyang toe ngon QB.
Meskipun apolipoprotein (hana QB quinone) ngon struktur nyang leungkap hanya mewakili dua jepretan dari perputaran situs QB, nibak serangkaian kejadian, na indikasi bahwa ikatan jeuet digerbangkan untok mencegah ikatan lom le hidrokuinon Untuk menghambat penghambatan substrat. Interaksi kinolol ngon kinon nyang toe ngon situs QB apolipoprotein mungken berbeda, nyang menyebabkan penolakan jih oleh RC. Kaleuh trep diusulkan bahawa perubahan konformasi berperan lam mengikat ngon reduksi kuin. Kemampuan RC beku untuk mengurangi kinon lheuh adaptasi gelap ka rusak (36); Kristalografi sinar-X geupeuleumah bahwa kerusakan nyoe diseubabkan le kinon QB nyang teujeubak lam konformasi “distal” kira-kira 4,5 Å dari posisi proksimal aktif (26) , 37). Kamoe meusarankan bahwa konformasi pengikatan distal nyoe nakeuh gambaran dari keadaan perantara antara apolipoprotein ngon struktur encin nyang peunoh, nyang meuikot interaksi awai ngon kinon ngon pembukaan situs QB.
RC tipe II nyang geuteumeung lam kompleks PSII bakteri fototrofik ngon bakteri siano terteunte, ganggang ngon tumbuhan na konservasi struktural ngon fungsional (38). Peularasan struktural nyang geupeuleumah bak Gambar 6 (D ngon E) geutekankan kesamaan antara RC PSII ngon situs QB kompleks RC bakteri. Peubandengan nyoe ka trep jeuet keu model untok meurunoe sistem nyang berhubongan erat dari pengikatan ngon reduksi kinon. Publikasi seugolom jih menunjukkan bahwa perubahan konformasi disertai deungon reduksi PSII kinon (39, 40). Oleh karena nyan, meunyo tapeutimang konservasi evolusioner RC, mekanisme mengikat yang segolom jih hana diamati nyoe mungken chit berlaku bak situs QB PSII RC bak bungong fototrofik yang beroksigen.
Rps ΔpufW (penghapusan pufW yang hana geubri label) dan strain PufW-His (protein-W yang geubri tanda C-terminal 10x His yang geu ekpresikan dari lokus pufW alami). palustris CGA009 ka geubri gamba lam karya kamoe seugolom jih (16). Strain nyoe ngon induk tipe liar isogenik jiteumee dari pembeku ngen cara ji coret sejumlah ubit sel bak PYE (maseng-maseng 5 g liter -1) (ji simpan lam LB bak suhu -80 °C, mengandung 50% ( w/v) gliserol) protein, ekstrak ragi ngon suksinat (]% agar/w [15]. Piring nyan geu inkubasi si malam lam seupot bak suhu ruangan lam kondisi anaerobik, lheuh nyan geu trang ngon cahya puteh (~50 μmolm-2 s-1) nyang geu seudia le boh lampu halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) seulama 3 sampoe 5 uroe sampoe saboh koloni deuh. Saboh koloni geupake keu inokulasi 10 ml media M22+ (41) nyang geutambah ngon 0,1% (w/v) asam kasamino (selanjut jih geukheun M22). Budaya nyan jitimoh lam kondisi oksigen nyang rendah lam seupot bak suhu 34°C ngon jiguncang bak 180 rpm seulama 48 jeum, lheuh nyan 70 ml kultur nyan ji inokulasi lam kondisi nyang saban seulama 24 jeum. Saboh kultur semi-aerobik deungon volume 1 ml dipakek untuk diinokulasi 30 ml media M22 lam botol kaca transparan universal 30 ml dan diiradiasi deungon agitasi (~50μmolm-2 s-1) seulama 48 jeum deungon gaya magnet steril Aduk rod. Lheueh nyan 30 ml kultur nyan geu inokulasi ngon kira-kira 1 liter kultur lam kondisi nyang saban, nyang lheuh nyan geu pakek untuk geu inokulasi kira-kira 9 liter kultur nyang geu terang bak ~200 μmolm-2 s-1 seulama 72 jeum. Sel-sel nyan geupanen ngon cara sentrifugasi bak suhu 7132 RCF seulama 30 minet, geususpensi lom lam ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), ngon geukeubah bak suhu -20°C sampoe geubutuhkan.
Lheuh ji cair, ji tamah padum boh kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggreh), lisozim (Merck, Inggreh) ngon dua boh tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggreh) keu sel nyang jisuspensi lom. Lam saboh sel teukanan Prancih 20.000 psi (Aminco, Amerika Serikat), sel-sel nyan ka meuganggu 8 sampoe 12 go. Lheueh geupeugadeh sel-sel nyang hana putôh ngon putoh-putoh nyang hana larut ngon cara sentrifugasi bak 18.500 RCF seulama 15 minet bak suhu 4°C, membran nyan geuendapkan dari lisaat pigmen ngon cara sentrifugasi bak 113.000 RCF seulama 2 jeum bak suhu 43.000°C. Buang fraksi nyang larut dan suspend lom membran nyang meuwarna lam 100 sampoe 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) dan homogenisasi sampoe hana agregat nyang deuh. Membran nyang ka teususon nyan geu inkubasi lam tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, Amerika Serikat) nyang na 2% (w/v) β-DDM seulama 1 jeum lam seupôt bak suhu 4°C ngon geuaduk lembut. Lheueh nyan sentrifugasi bak suhu 70°C keu ji larutkan 150.000 RCF bak suhu 4°C seulama 1 jeum keu ji peugadeh sisa-sisa nyang hana larut.
Membran pelarut dari strain ΔpufW dipeulaku bak kolom pertukaran ion Sepharose DEAE 50 ml deungon lhee volume kolom (CV) penyangga pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8,0) nyang mengandung 0,03% (w/v) β-DDM]. Rah kolom ngon dua boh penyangga pengikat CV, lheuh nyan rhah kolom ngon dua boh penyangga pengikat nyang na 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 dielusi deungon gradien linier 150 sampoe 300 mM NaCl (lam penyangga pengikat) bak 1,75 CV, ngon kompleks pengikat nyang teusisa dielusi deungon penyangga pengikat nyang mengandung 300 mM NaCl bak 0,5 CV. Kumpoi spektrum absorpsi antara 250 ngon 1000 nm, tapeutheun fraksi ngon rasio absorbansi (A880/A280) leubeh rayeuk nibak 1 bak 880 sampoe 280 nm, tapeuencer dua goe lam penyangga meuikat, ngon tapeuguna lom prosedur nyang saban bak kolom DEAE Bak pemurnian. Encerkan fraksi-fraksi deungon rasio A880/A280 leubeh manyang dari 1,7 dan rasio A880/A805 leubeh manyang dari 3,0, peugot putaran keu lhee pertukaran ion, dan peutheun fraksi-fraksi deungon rasio A880/A280 leubeh manyang dari 2,2 dan rasio A880/A805 leubeh manyang dari.0. Kompleks nyang ka geumurnikan seubagian geukonsentrasikan sampoe ~2 ml lam filter sentrifugal cut-off brat molekul Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Inggréh), ngon geumuat bak kolom eksklusi ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) nyang mengandung penyangga NaM thelume, 1,5 boh CV. Kumpoi spektrum absorpsi dari fraksi eksklusi ukuran, dan konsentrasi spektrum absorpsi deungon rasio A880/A280 di ateuh 2,4 dan rasio A880/A805 di ateuh 5,8 sampoe 100 A880, dan langsong dipakek untuk persiapan grid cryo-TEM atawa penyimpanan perlu C.
Membran pelarut dari galur PufW-Nya geuboh bak kolom Sepharose Ni-NTA HisPrep FF 20 ml (tris-HCl 20 mM (pH 8,0) nyang mengandung NaCl 200 mM dan 0,03% (b/b)) lam penyangga IMAC Kesehatan ( GE). v) β-DDM]. Kolom nyan geuraseu ngon limong CV penyangga IMAC, lheuh nyan ngon limong CV penyangga IMAC nyang na histidin 10 mM. Kompleks inti dielusi dari kolom ngen limong penyangga IMAC nyang mengandung histidin 100 mM. Fraksi nyang na kompleks RC-LH114-W geukonsentrasikan sampoe ~10 ml lam tangki nyang geuaduk nyang geupeuleungkap ngon filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggréh), geuencerkan 20 kali ngon penyangga pengikat, lheuh nyan geutamah sampoe 25 ml Lam penyangga DEAE b dilee. Rah kolom ngon peut boh penyangga pengikat CV, lheuh nyan eluasi kompleks bak lapan boh CV bak gradien linier 0 sampoe 100 mM NaCl (lam penyangga pengikat), dan sisa peut boh CV nyang mengandung 100 mM penyangga pengikat Rasio kompleks A8A2 dielusi ngon natri8de20. leubeh manyang nibak 2,4 dan rasio A880/A805 leubeh manyang nibak 4,6 fraksi geukonsentrasikan sampoe ~2 ml lam filter sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, dan geupeupasoe ngon 1,5 CV IMAC dilee Penyangga nyang diseimbangkan Superdex 200 di ateuh penyangga 16/600. 1,5 boh CV. Kumpoi spektrum absorpsi dari fraksi ukuran-eksklusif ngon konsentrasi spektrum absorpsi ngon rasio A880/A280 ateuh 2,1 ngon rasio A880/A805 ateuh 4,6 sampoe 100 A880, nyang langsong dipakek keu persiapan grid TEM beku atawa disimpan bak -80°C.
Saboh freezer immersi Leica EM GP geungui keu geupeusiap kisi TEM suhu miyueb. Kompleks nyan diencerkan lam penyangga IMAC sampoe A880 dari 50, lheuh nyan 5μl dipeutamong lam jala teumaga QUANTIFOIL 1,2/1,3 nyang baroe dipeuteubiet cahaya (Agar Scientific, Inggris). Inkubasi grid bak suhu 20°C ngon kelembaban relatif 60% seulama 30 s, lheuh nyan blot thoe seulama 3 s, lheuh nyan peu mate lam etan cair bak suhu -176°C.
Data kompleks RC-LH114-W geucatat bak eBIC (Pusat Bioimaging Elektronik) (Sumber Cahaya Berlian Inggréh) ngon mikroskop Titan Krios, nyang meubut bak teugangan percepatan 300kV, ngon pembesaran nominal Choose gap 130.000 dari-V ngon an Saboh Gatan 968 GIF Quantum ngon detektor puncak K2 geungui keu geureukam gamba lam mode meuhitong keu geukumpoi data. Ukuran piksel yeng dikalibrasi adalah 1,048Å, ngen tingkat dosis adalah 3,83 e-Å-2s-1. Meukumpôi filem nyan lam 11 detik dan geubagi jeuet keu 40 boh bagian. Gunakan area nyang dilapisi karbon untuk neufokuskan lom mikroskop, lheuh nyan neukumpoi lhee boh filem per lubang. Lam jumlah mandum, 3130 boh filem nyang ka jikumpôi, ngon nilai defokus antara -1 ngon -3μm.
Data keu kompleks RC-LH116 geukumpoi ngon geungui mikroskop nyang saban di Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggréh). Data dikumpoi dalam mode meuhitong deungen pembesaran 130 k, ngen ukuran piksel dikalibrasi keu 1,065 Å deungen dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film nyoe geureukam lam watee 12 detik dan geubagi jeut keu 48 boh bagian. Lam jumlah mandum, 3359 boh filem nyang ka jikumpoi, ngon nilai defokus antara -1 ngon -3μm.
Mandum pengolahan data geupeugot lam pipa Relion 3.0 (42). Gunakan Motioncorr 2 (43) untuk memperbaiki gerak balok dengan cara menilai dosis, dan kemudian gunakan CTFFIND 4.1 (44) untuk menentukan parameter CTF (fungsi pemindahan kontras). Fotomikrograf khas lheuh tahap pemrosesan awai nyoe dipeudeuh bak Gambar 2. S16. Templat pemilihan otomatis nyan geuhasekan ngon cara geupiléh seucara manual kira-kira 250 piksel dari 1000 partikel lam bingkai 250 piksel ngon hana referensi klasifikasi dua dimensi (2D), ngon nyan geutulak klasifikasi-klasifikasi nyan nyang meupeunoh kontaminasi sampel atawa hana ciri-ciri nyang jeuet deuh. Lheueh nyan, seleksi otomatis geupeugot bak mandum mikrofoto, ngon RC-LH114-W nakeuh 849.359 partikel, ngon kompleks RC-LH116 nakeuh 476.547 partikel. Mandum partikel nyang geupiléh ka geualami dua boh putaran klasifikasi 2D non-referensi, ngon lheuëh tiep-tiep lari, partikel nyang meurumpok wilayah karbon, kontaminasi sampel, hana fitur nyang jeulaih atawa partikel nyang tumpang tindeh that geutulak, hasé jih 772.033 (90,9%) ngon 359.033 partikel nyang geungui 359.D%) (partikel3578 )d. RC-LH114-W dan RC-LH116 maseng-maseng. Model referensi 3D awai dihasekan deungen dipakek metode keturunan gradien stokastik. Deungon geungui model awai seubagoe acuan, partikel-partikel nyang geupiléh geubagi jeuet keu peuët boh kategori lam 3D. Meunyo tapeuguna model lam kategori nyoe seubagoe referensi, tapeulaku pemurnian 3D bak partikel-partikel lam kategori paleng rayeuk, lheuh nyan tapeuguna filter low-pass 15Å awai keu tapeutop wilayah pelarut, tapeutamah 6 piksel binteh leumoh, ngon tapeuproses piksel-piksel nyan keu tapeubetoi fungsi transfer Gatan K2 ateuh puncak Mo. Untuk dataset RC-LH114-W, model awai nyoe geumodifikasi deungon geupeugadeh kepadatan nyang teuga bak bineh masker (geuputoh dari kepadatan kompleks inti di UCSF Chimera). Model yeng dihasekan (resolusi RC-LH114-W ngen RC-LH116 maseng-maseng 3,91 ngen 4,16 Å) dipakek seubagai referensi keu putaran keudua klasifikasi 3D. Partikel-partikel nyang geungui geukelompokkan lam glah 3D awai dan hana meuasoe korelasi nyang teuga ngon lingkungan. Tumpang tindeh atawa kureung fitur struktural nyang jeulaih. Lheueh putaran keudua klasifikasi 3D, kategori nyang na resolusi paleng manyang geupiléh [Untuk RC-LH114-W, saboh kategori nakeuh 377.703 partikel (44,5%), keu RC-LH116, na dua boh kategori watee hanya 260.752 partikel (di sinoe) awaknyan sa7me. lheuh rotasi awai deungon perbedaan ubeut]. Partikel-partikel nyang ka geupiléh nyan geu-ekstraksi lom lam kotak 400 piksel ngon geupeuhalôh ngon cara geupeuhalôh 3D. Masker pelarut nyan geuhasekan ngon geungui filter low-pass 15Å awai, ekspansi peta 3 piksel ngon masker leumoh 3 piksel. Deungon geungui peugleh CTF per-partikel, koreksi gerak per-partikel ngon putaran keudua peugleh CTF per-partikel, peugleh 3D, peunutop pelarut ngon pasca-pengolahan geupeugot lheuh tiep langkah keu geupeugleh leubeh lanjut tekstur nyang ka geuhase. Deungon geungui nilai cut-off FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) 0,143, resolusi model akhe RC-LH114-W ngon RC-LH116 nakeuh 2,65 ngon 2,80Å. Kurva FSC dari model akhe dipeudeuh bak Gambar 2. S17.
Mandum urutan protein geucok nibak UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) dipakek untuk membangun model homologi RC, yang mengandung urutan protein RC-L, RC-M dan RC-H dan struktur kristal Rba. RC geungui seubagoe cetakan (ID PDB: 5LSE) (46). Gunakan alat “peta pas” lam Chimera UCSF untuk pas model nyang dihasekan keu peta (47), peugot struktur protein, ngon kofaktor [4×BChl a (nan residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), saboh atawa dua boh jeuneh UQ10 (U10), saboh non-heron (iron) ngon saboh non-heron 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] geungui Coot (48) keu geutamah. Kareuna QAK hana na lam perpustakaan monomer, maka diparameterkan ngon alat eLBOW lam PHENIX (49).
Seulaen nyan, subunit LH1 dipeugot. Awai jih, alat konstruksi otomatis lam PHENIX (49) dipakek untuk secara otomatis membangun bagian dari urutan LH1 dipakek peta dan urutan protein LH1-α dan LH1-β sebagai input. Pileh subunit LH1 nyang paleng lengkap, ekstrak dan muat lam Coot, secara manual tamah urutan nyang gadoh lam nyan, dan secara manual tapeusempurna mandum struktur sigohlom tamah dua BCls a (BCL) dan saboh spirilloxanthin (CRT) [meunurot Rps nyang bersangkutan Kepadatan kompleks LH1 dan kandungan karoten nyang dituri. Jeunèh-jeunèh (17)]. Salin subunit LH1 nyang lengkap, dan pakek “Alat Peta Docking” Chimera UCSF untuk berlabuh di daerah non-model nyang toe ngon kepadatan LH1, dan lheuh nyan tapeusempurna di Coot; ulang proses nyan sampoe mandum subunit LH1 ka geumodelkan. Untuk struktur RC-LH114-W, ngen geu ekstraksi kepadatan nyang hana dialokasikan di Coot, protein geu pisah dari komponen non-protein nyang teusisa lam peta Chimera USCF ngon alat Autobuild dipakek untok geu peuget model awai, ngon pemodelan subunit nyang teusisa (protein-W). Lam FENIKS (49). Tambah urutan nyang gadeh keu model nyang dihasekan lam Coot (48), dan lheuh nyan seucara manual tapeusempurna mandum subunit. Kepadatan nyang hana dialokasikan nyang teusisoe cocok ngon kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB dari CDL = CDL, POPC = 6PL ngon POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) ngon molekul UQ10 (U10). Gunakan optimasi PHENIX (49) ngon optimasi manual lam Coot (48) keu tapeusempurna model awai nyang lengkap sampoe statistik model ngon kualitas visual nyang pas hana jeuet tapeutingkat leubeh lanjot. Akhe jih, pakek LocScale (50) untuk meuasah peta lokal, dan lheuh nyan dipeuget padum boh siklus laen dari pemodelan kepadatan yang hana dialokasikan dan optimasi otomatis dan manual.
Peptida, kofaktor ngon lipid ngon kinon laen nyang berlabuh lam kepadatan maseng-maseng dipeudeuh bak Gambar 1 ngon 2. S18 sampoe S23. Informasi statistik dari model akhe dipeudeuh lam Tabel S1.
Kecuali meunyo dipeugah laen, spektrum seurapan UV/Vis/NIR dikumpoi bak spektrofotometer Cary60 (Agilent, Amerika Serikat) bak interval 1 nm dari 250 nm sampoe 1000 nm ngon watee integrasi 0,1s.
Encerkan sampel lam kuvet kuarsa deungon jalur 2 mm keu A880 dari 1, dan peusapat spektrum absorpsi antara 400 ngon 1000 nm. Spektrum dikroik meulingka dikumpoi bak spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) bak interval 1 nm antara 400 nm ngen 950 nm bak tingkat pemindaian 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar dipeuteunte deungon cara diencerkan kompleks inti jeut keu A880 kira-kira 50. Diencerkan volume 10μl lam penyangga pengikat 990μl atawa metanol, dan dikumpoi spektrum absorpsi segera untuk meminimalkan degradasi BChl. Kandungan BChl nibak tiep-tiep sampel metanol geuhitong ngon koefisien kepunahan bak 771 nm dari 54,8 mM-1 cm-1, ngon koefisien kepunahan geupeuteuntèe (51). Bagi konsentrasi BChl nyang diuko deungon 32 (RC-LH114-W) atawa 36 (RC-LH116) untuk neuteupeu konsentrasi kompleks inti, nyang lheuh nyan dipakek untuk neuteupeu spektrum absorpsi dari sampel nyang sama nyang dikumpoi lam koefisien Kepunahan penyangga. paralel. Lhee boh pengukuran nyang meu ulang-ulang geucok keu tiep-tiep sampel, dan rata-rata absorbansi maksimum BChl Qy geupake keu perhitungan. Koefisien kepunahan RC-LH114-W nyang geu uko bak 878 nm adalah 3280±140 mM-1 cm-1, seudangkan koefisien kepunahan RC-LH116 nyang geu uko bak 880 nm adalah 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 geu uko meunurot cara lam (52). Singkat haba, HPLC fase teubalek (RP-HPLC) geupeugot ngon sistem HPLC Agilent 1200. Larutkan sekitar 0,02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50μl metanol:kloroform 50:50 yang mengandung 0,02% (w/v) klorida besi, dan suntikkan larutan Beckman Coulter yang telah diseimbangkan sebelumnya pada min. 40°C lam pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) bak kolom ×25 cm. Peuget elusi isokratik lam pelarut HPLC untuk memantau absorbansi bak 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) ngon 780 nm (BChl) seulama 1 jeum. Puncak lam kromatogram 275 nm bak 25,5 minet ka terintegrasi, nyang hana mengandung senyawa laen nyang jeut dideteksi. Luah nyang terintegrasi nyan geungui keu geuhitong jumlah molar UQ10 nyang geuekstraksi ngon geuacu bak kurva kalibrasi nyang geuhitong dari injeksi standar murni dari 0 sampoe 5,8 nmol (Gambar S14). Tiëp-tiëp sampel dianalisis lam lhee boh ulangan, dan keusalahan nyang dilaporkan seusuai deungon SD rata-rata.
Saboh larutan nyang na kompleks RC-LH1 ngon absorpsi Qy maksimum 0,1 geupeugot ngon 30 μM sitokrom jantung kuda c2 (Merck, Inggréh) ngon 0 sampoe 50 μMUQ2 (Merck, Inggréh). Lhee boh sampel 1-ml disiapkan bak tiep konsentrasi UQ2 dan diinkubasi si malam lam seupot bak suhu 4°C untok dipastikan adaptasi nyang leungkap keu seupot sigohlom diuko. Larutan nyan geubôh lam spektrofotometer modular OLIS RSM1000 nyang geupeuleungkap ngon kisi-kisi apui/500 gareh 300 nm, celah tamong 1,24 mm, celah teungoh 0,12 mm ngon celah teubiet 0,6 mm. Saboh filter pass panyang 600 nm dipeuduek bak pinto tamong fototabung sampel ngon tabung fotomultiplier referensi untuk dipeugadeh cahaya eksitasi. Absorbansi nyan dipantau bak 550 nm deungon watee integrasi 0,15 s. Cahya eksitasi nyan geupeuteubiet nibak LED M880F2 880 nm (Dioda Peuteubiet Cahya) (Thorlabs Ltd., Inggréh) rot kabel serat optik bak intensitas 90% rot kontroler DC2200 (Thorlabs Ltd., Inggréh) ngon geupeuteubiet keu sumber cahya bak sudot 9°. Berkas uko nyan geulawan ngon cermin keu geubri pulang cahya peu mantong nyang awai jih hana geuseurap le sampel. Pantau absorbansi 10 s sigohlom pencahayaan 50 s. Kemudian absorbansi nyan dipantau leubeh lanjot seulama 60 s lam seupot untuk menilai sejauh mana quinolol secara spontan mengurangi sitokrom c23 + (kalon Gambar S8 untuk data mentah).
Data nyan diproses deungon cara dipeupadu laju awai linier lam watee 0,5 sampoe 10 s (tergantung bak konsentrasi UQ2) dan dipeurata laju dari lhee sampel bak tiep konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 yeng dihitong le koefisien kepunahan maseng-maseng dipakek untuk meuubah tingkat jeut keu efisiensi katalitik, diplot di Origin Pro 2019 (OriginLab, Amerika Serikat), ngen dipeuget keu model Michaelis-Menten untuk meupeutente nilai Km ngen Kcat yeng jeulah.
Untuk pengukuran seurapan sementara, sampel RC-LH1 diencerkan sampoe ~2μM lam penyangga IMAC nyang mengandung natrium askorbat 50 mM (Merck, Amerika Serikat) dan Terbutin 0,4 mM (Merck, Amerika Serikat). Asam askorbat dipakek seubagoe donor elektron pengorbanan, dan tert-butaclofen dipakek seubagoe inhibitor QB untuk memastikan bahwa donor RC utama teutap reduksi (yaitu, hana fotooksidasi) sepanjang proses pengukuran. Kira-kira 3 ml sampel geutamah lam sel rotasi khusus (kira-kira 0,1 m diameter, 350 RPM) ngon panyang jalur optik 2 mm keu geupeupastikan bahwa sampel lam jalur laser na watee nyang cukop keu adaptasi seupôt antara pulsa eksitasi. Gunakan pulsa laser ~100-fs untuk memperkuat sistem laser Ti: Safir (Fisika Spektra, Amerika Serikat) untuk menggairahkan sampel bak 880 nm bak laju pengulangan 1 kHz (20 nJ untuk NIR atau 100 nJ untuk Vis). Sigohlom tapeusapat data, tapeuhah sampel bak cahaya eksitasi seulama kira-kira 30 minet. Paparan akan menyebabkan inaktivasi QA (mungken mengurangi QA sigo atawa dua go). Tapi harap neu ingat bahwa proses nyoe jeut dipeubalek kareuna lheuh masa adaptasi gelap nyang trep, RC akan perlahan-lahan kembali keu kegiatan QA. Saboh spektrometer Helios (Sistem Ultrafast, Amerika Serikat) dipakek keu geu uko spektrum fana ngen wate penundaan -10 sampoe 7000 ps. Gunakan perangkat lunak Surface Xplorer (Sistem Ultrafast, Amerika Serikat) keu neubuka kelompok data, lheuh nyan neugabong ngon neubakukan. Gunakan paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) untuk gunakan himpunan data yeng digabongkan untuk meutumeng spektrum diferensial yeng meukaet deungen peluruhan, atau gunakan fungsi yeng meulibatkan padim boh eksponen deungen respon instrumen untuk seusuai deungen evolusi spektral panyang gelombang tunggal di Asal (Asal USA).
Lagee nyang ka geukheun di ateuh (53), saboh pilem fotosintesis nyang na kompleks LH1 nyang hana antena RC ngon antena LH2 perifer ka geupeusiap. Membran nyan geuencerkan lam tris 20 mM (pH 8,0) lheuh nyan geuboh lam kuvet kuarsa ngon jalur optik 2 mm. Saboh pulsa laser 30nJ dipakek untuk menggairahkan sampel bak 540 nm deungon watee penundaan -10 sampoe 7000 ps. Proses data set lagee nyang ka dipeugah keu Rps. pal sampel nyan.
Membran nyan dipeulet ngon cara sentrifugasi bak 150.000 RCF seulama 2 jeum bak suhu 4°C, lheuh nyan absorbansi jih bak 880 nm disuspensi lom lam tris-HCl 20 mM (pH 8,0) ngon NaCl 200 mM. Larutkan membran ngon cara geu-aduk lam 2% (w/v) β-DDM seulama 1 jeum lam seupôt bak suhu 4°C. Sampel nyan geuencerkan lam trietilammonium karbonat 100 mM (pH 8,0) (TEAB; Merck, Inggréh) sampoe konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Peugot leubeh lanjot geupeugot dari cara nyang ka geupeuteubiet sigohlom jih (54), geumulai ngon geuencerkan 50 μg protein jeut keu total 50 μl TEAB nyang na 1% (w/v) natrium laurate (Merck, Inggréh). Lheueh sonikasi seulama 60 s, geupeukureuëng ngon tris (2-karboksietil) fosfin (Merck, Inggréh) 5 mM bak suhu 37°C seulama 30 minèt. Untuk S-alkilasi, inkubasi sampel ngon metil S-metiltiometansulfonat 10 mM (Merck, Inggris) dan tamah dari larutan stok isopropanol 200 mM seulama 10 minet bak suhu ruangan. Pencernaan proteolitik geupeugot ngon cara geutamah 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) ngon geu inkubasi bak suhu 37°C seulama 3 jeum. Surfaktan laurate geu ekstraksi ngon geu tamah 50 μl etil asetat ngon 10 μl asam trifluoroasetat (TFA; Thermo Fisher Scientific, Inggréh) glah LC ngon geu vortex seulama 60 s. Peumisah fase nyan dipromosikan ngon cara sentrifugasi bak 15.700 RCF seulama 5 minet. Meunurot protokol pabriek, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Inggréh) geungui keu geuaspirasi ngon geubôh sira ngon hati-hati bak fase miyueb nyang na peptida. Lheh tho deungen sentrifugasi vakum, sampel dilarutkan dalam 0,5% TFA ngen 3% asetonitril, ngen 500 ng dianalisis deungen kromatografi RP aliran nano yeng dipeugabong deungen spektrometri massa dipakek parameter sistem yeng dipeurinci sigolom jih.
Gunakan MaxQuant v.1.5.3.30 (56) untuk identifikasi dan kuantifikasi protein untuk mita Rps. database proteom palustris (proteom). Data proteomik spektrometri massa kaleuh ji simpan lam Aliansi Pertukaran Proteom melalui repositori mitra PRIDE (http) di miyup pengidentifikasi dataset PXD020402.
Untuk analisis le RPLC dipeugabong ngen spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 disiapkan dari Rps tipe liar. Deungon geungui cara nyang ka geupeuteubiet sigohlom jih (16), konsentrasi protein nyang geupeuhasé lam sel palustris nakeuh 2 mg ml-1 lam Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM ngon 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Meunurot protokol pabriek, pakek alat pemurnian 2D (GE Healthcare, Amerika Serikat) untuk ekstrak 10 μg protein deungon cara pengendapan, dan larutkan endapan lam 20 μl asam formik (FA) 60% (v/v), 20% (v/v) Asetonitril dan 20% ie (vvv). Limong mikroliter dianalisis ngon RPLC (Dionex RSLC) nyang dipeugabong ngon spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gunakan kolom MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Inggris) untuk pemisahan pada suhu 60°C dan 100μlmin -1, dengan gradien 85% (v/v) pelarut A [0,1% (v/v) pelarut FA dan 0,02% (v/v) larutan B8/v a [0,1%(v/v) FA ngon 0,02%(v/v) lam 90%(v/v) asetonitril TFA] Deungon geungui sumber ionisasi elektrosemprot standar ngon parameter default leubeh nibak 60 minet, spektrometer massa meuteumee 100 sampoe 2750 m/z (rasio massa-keu-muatan). Deungon bantuan alat portal sumber daya bioinformatika ExPASy FindPept, tapeugot peta spektrum massa keu subunit kompleks.
Sel-sel nyan geupeutimoh seulama 72 jeum di miyup 100 ml cahya NF-rendah (10μMm-2 s-1), menengah (30μMm-2 s-1) atawa tinggi (300μMm-2 s-1). Media M22 (media M22 nyang amonium sulfat geupeugadeh dan natrium suksinat geugantoe ngon natrium asetat) lam botol 100 ml nyang na ateuh sekrup (23). Lam limong siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron dipeuget manik-manik bak rasio volume 1:1 untuk dilise sel-sel dan dipeulupie di ateuh eh seulama 5 minet. Bahan nyang hana larut, sel nyang hana puteh ngon manik-manik kaca dipeugadeh ngon cara sentrifugasi bak 16.000 RCF seulama 10 minet lam mikrosentrifugasi ateuh bangku. Membran nyan geupisah lam rotor Ti 70,1 ngon 100.000 RCF lam tris-HCl 20 mM (pH 8,0) ngon gradien sukrosa 40/15% (w/w) seulama 10 jeum.
Lagee nyang ka geubri gamba lam karya kamoe seugolom jih, imunodeteksi tag His bak PufW (16). Singkat jih, kompleks inti nyang dimurnikan (11,8 nM) atawa membran nyang mengandung konsentrasi RC nyang sama (ditentukan le oksidasi nyang dipeukureng spektrum perbedaan nyang dipeukureng ngon dipeucocok beban bak gel nyang diwarnai) lam 2x penyangga pemuatan SDS (Merck, Inggris) nyang diencerkan dua goe. Protein nyan ji pisahkan bak replika gel Nupage bis-tris 12% (ilmiah termo fisher, Inggris). Saboh gel diwarnai ngen Biru Cemerlang Coomassie (Bio-Rad, Inggris) untuk memuat ngen meugambakan subunit RC-L. Protein bak gel keudua ji pinah keu membran poliviniliden fluorida (PVDF) nyang ji aktifkan le metanol (Thermo Fisher Scientific, Inggris) keu imunoassay. Membran PVDF geublokir lam tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, susu bubuk skim Tween-20 0,2% (v/v), lheuh nyan geuinkubasi ngon antibodi primer anti-His (lam penyangga mH0p 7,6), NaCl 150 mM ngon 0,05% (v/v) Tween-20] lam 1:1000 A190-114A, Laboratorium Betil, Amerika Serikat) seulama 4 jeum. Lheueh geuraseu 3 goe seulama 5 minet lam penyangga antibodi, membran nyan geugabong ngon antibodi sekunder anti-tikoh lobak peroksidase (Sigma-Aldrich, Inggréh) (geuencerkan 1:10.000 lam penyangga antibodi) W inkubasi sampoe memungkenkan deteksi (5 minet lheuh 3 goe geuraseu lam penyangga antibodi kemistrat EESTA0). (Cyanagen, Italia) ngon Pencitra Amersham 600 (Perawatan Kesehatan GE, Inggréh).
Deungon geugamba distribusi intensitas tiep-tiep gel meuwarna atawa jalur imunoassay, geuintegrasikan area di miyup puncak ngon geuhitong rasio intensitas RC-L (gel meuwarna) ngon Protein-W (imunoassay), lam GambarJ (57) Meuproses gamba. Rasio nyo diubah jeut rasio molar deungen mengasumsikan bahwa rasio RC-L deungen protein-W dalam sampel RC-LH114-W murni adalah 1:1 ngen menormalkan mandum himpunan data yeng seusuai.
Keu bahan tambahan keu tulesan nyoe, neukalön bak http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Nyoë nakeuh saboh artikel akses teubuka nyang geusebarkan meunurot syarat Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel nyan meumungkenkan penggunaan, distribusi, ngon reproduksi hana bataih lam media peu mantong deungon syarat karya asli jih dikutip deungon beutoi.
Catatan: Kamoe hanya meulakee droeneuh neubri alamat email droeneuh supaya ureung nyang droeneuh rekomendasikan keu laman nyan jiteupeu bahwa droeneuh neumeuheut awak nyan kalon email nyan dan bahwa email nyan kon spam. Kamoe hana akan meureukam alamat email sapeu.
Soalan nyoe geungui keu geutes peuë droëneuh nakeuh ureuëng tamong ngon geucegah otomatis neukirém spam.
Daud j.k.
Struktur resolusi tinggi kompleks jeupang cahaya 1 di pusat reaksi geubri wawasan baroe teuntang dinamika kinon.
Daud j.k.
Struktur resolusi tinggi kompleks jeupang cahaya 1 di pusat reaksi geubri wawasan baroe teuntang dinamika kinon.
©2021 Asosiasi Amerika keu Kemajuan Sains. mandum hak geukeubah. AAAS nakeuh mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. Kemajuan Sains ISSN 2375-2548.